[发明专利]一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液

说明书

本发明公开了一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液。本方法是在冻存前，使用海藻酸钠包裹猪胰岛细胞，在不影响正常代谢水平的前提下，构成相对稳定三维附着空间，使其在冻存‑复苏过程后保障稳定的回收率(>60％)和胰岛素分泌功能，以达到建立胰岛细胞库的目的。

技术领域

本发明属于动物胰岛细胞超低温保存技术领域，具体涉及一种可用于胰岛细胞冻存-复苏方法，以及冻存液和复苏液。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌疾病，长时间以来严重困扰着人类的健康，其产生的原因是患者体内胰岛素分泌相对不足(Ⅱ型糖尿病)或者绝对不足(Ⅰ型糖尿病)。据2017年国际糖尿病联盟(IDF)发布的第八版全球糖尿病地图显示全球患病人数已超过4亿，而在我国糖尿病患者人数已达1.1亿。目前治疗糖尿病的主要方法为皮下注射外源性胰岛素，这种方法虽然取得了显著的疗效但也引发了一系列诸如胰岛素水肿、严重低血糖、过敏反应、皮下脂肪营养不良等副作用。早在1972年，Ballinger和Lacy便通过移植纯化的胰岛细胞治愈了兔的糖尿病(Ballinger&Lacy,1972)，而随着胰岛细胞移植技术的日趋成熟，这一技术已经逐渐成为一种可替代的糖尿病治疗方法。但目前胰岛供体严重不足这一问题，即便是采用异种移植(Xenotransplantation)、选择猪作为胰岛细胞供体，也可能会出现无法满足短时间高需求的情况。所以，胰岛细胞的长期保存成为了解决根本问题的关键。

目前，胰岛细胞的长期保存主要通过冻存(Cryoperservation)来实现，多数胰岛细胞冻存方法的核心是通过低温降低细胞代谢以达到长期保存的效果，并借助冻存保护剂来减少在降温过程中细胞团周边溶液或细胞内部产生的冰晶，以保护细胞团的完整性(McGann et al.,1988)。但在0～-60℃这个温度范围区间，仅通过冻存保护剂不能完全避免冰晶对细胞团的损伤，这将严重影响细胞复苏后的回收率、活率及功能，也无法满足短时间获得足量胰岛细胞的需求。

胰岛细胞的微囊化由于其具免疫隔离、生物相容性、通透性好等特点(Petruzzoet al.,1991；Zimmemerman et al.,1992；Calafiore et al.,1992；Cleland,1997；Dufrane et al.,2006；Safley et al.,2008)，多年以来一直被广泛研究，而制备微囊的材料是决定微囊性能的关键因素，一般要求其成膜性、稳定性好，且具备适合进行移植的特点。目前研究报道较多的材料主要分为天然材料(琼脂糖、神经鞘髓磷脂、海藻酸盐、壳聚糖、明胶、纤维蛋白等)、半合成材料(羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素等)及合成材料(乳酸乙醇酸共聚物、聚氨基酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯等)这三类。而相较于半合成材料与合成材料的生物相容性及成本问题，天然材料所具备的无毒、免疫原性低、可降解且产物无毒副作用等特点，对于移植物的保护有更为深远的意义。

海藻酸盐是一种从海藻类植物(海带、裙带菜、紫菜等)中提纯的阴离子多糖，这种线性聚合物由两个基团组成，mannuronate(M)和guluronate(G)，它们分别以不同的浓度、排列方式分散在海藻酸盐中。位于植物茎干部分海藻糖G基团浓度高，而叶片中的海藻糖M基团浓度更高，这一差别导致了植物不同部位的柔韧程度不同。对于胰岛的微囊化而言，海藻酸盐具有可以更快地与阳离子结合形成凝胶、接触柠檬酸盐会使阳离子脱离海藻酸盐的结合还原为液体等特性(Martinsen et al.,1989；Morch et al.,2006)，使其成为胰岛微囊化的最佳材料。