[发明专利]细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法在审
| 申请号： | 201910193809.3 | 申请日： | 2019-03-14 |
| 公开（公告）号： | CN109917058A | 公开（公告）日： | 2019-06-21 |
| 发明（设计）人： | 吴望军;姜爱文;刘红林;董超;张锡英 | 申请（专利权）人： | 南京农业大学 |
| 主分类号： | G01N30/74 | 分类号： | G01N30/74;G01N30/06 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 徐冬涛;李晓峰 |
| 地址： | 211225 江苏省南京市溧*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 脱氧核苷酸 游离 细胞 高效液相测定 流动相 高效液相色谱测定 等梯度洗脱 色谱条件 细胞分析 有效分离 波长 柱温 | ||
1.一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，其特征在于：该方法通过对从细胞中提取四种脱氧核苷酸进行高效液相色谱分析，根据标准曲线方程得出四种脱氧核苷酸的含量；所述的四种脱氧核苷酸包括腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱：InertSustain AQ-C18色谱柱；
流动相A：40-60mM KH2PO4，pH5.0-6.0；
流动相B：CH3OH；
流速：1.0ml/min；
波长：260nm；
柱温：40℃；
洗脱方式：等梯度洗脱，A:B＝90:10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的流动相A为50mM KH2PO4，pH5.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：从细胞中提取四种游离脱氧核苷酸的过程为：待细胞长满至T75后，胰酶消化收集细胞，PBS清洗细胞一次；加入0.3mM三氯乙酸，混匀后冰浴，然后离心吸取上清液，调节pH至5.0～5.5，上机检测前使用0.22um微孔滤头过滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述三氯乙酸的加入量为每10mg细胞沉淀加入100ul 0.3mM三氯乙酸，所述冰浴的时间为10min，所述离心的条件为12000g离心10min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：用5mM氢氧化钾调节pH至5.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准曲线方程是将四种脱氧核苷酸的标准品溶液经高效液相色谱分析得到的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述四种脱氧核苷酸标准品溶液的配制过程为：分别称取dAMP、dGMP、dTMP、dCMP标准品各10mg，加10ml超纯水配置成浓度单位1mg/ml的储备液；分别移取1ml各标准品溶液，使用超纯水稀释至浓度为200、400、600、800、1000ug/ml的单一标准品溶液；分别将相同浓度的四种标准品溶液混合制得浓度梯度为50、100、150、200、250ug/ml的混合标准品溶液。
8.权利要求1～7中任一所述的方法在生物化学、细胞生物学、医学等生命科学中测定细胞内四种游离脱氧核苷酸中的应用。
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