[发明专利]细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法

说明书

本发明公开了一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，色谱条件为：InertSustain AQ‑C18色谱柱；流动相A：40‑60mM KH₂PO₄，pH5.0‑6.0；流动相B：CH₃OH；流速：1.0ml/min；波长：260nm；柱温：40℃；等梯度洗脱，A:B＝90:10。本发明的细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相色谱测定方法，能有效分离细胞内四种游离的脱氧核苷酸，操作简单，重复性好，其测定的精密度满足细胞分析的要求。

技术领域

本发明涉及一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，属于生物化学与细胞生物学技术领域。

背景技术

除部分病毒外，机体的遗传物质均为脱氧核糖核苷酸(DNA)，脱氧核苷酸是其基本的结构和功能单位。一个脱氧核糖核苷酸分子由一分子含氮碱基、一分子脱氧核糖、一分子磷酸组成，其中碱基有四种，分别是腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶胞(C)和鸟嘌呤(G)。研究表明，核苷酸池是细胞进行核酸合成及生化反应的基础，核苷酸池内各成分的稳定对机体健康具有重要意义，而四种脱氧核苷酸，作为遗传物质的组成基础以及核苷酸池中的重要组成，在机体细胞生长发育过程中发挥重要的作用，且与机体的能量代谢、分子合成息息相关，因此，对细胞内四种脱氧核苷酸的检测，对反映细胞内核苷酸池的稳定性，从而评估细胞、组织甚至机体的健康状态具有重要意义。但一直以来，关于分离食品、细胞、组织中的核糖核苷酸的方法研究较多，但脱氧核苷酸，尤其是细胞内脱氧核苷酸的组分分离分析仍未见报道。

脱氧核苷酸是生物体遗传物质DNA的基本的结构和功能单位，生物体中脱氧核苷酸含量变化与机体的各种生命活动息息相关，建立生物体细胞中四种脱氧核苷酸的检测方法，对深入了解机体的各种生命活动的调控机制具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同时测定细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种细胞内四种游离脱氧核苷酸的高效液相测定方法，该方法通过对从细胞中提取四种脱氧核苷酸进行高效液相色谱分析，根据标准曲线方程得出四种脱氧核苷酸的含量；所述的四种脱氧核苷酸包括腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：

色谱柱：InertSustain AQ-C18色谱柱；

流动相A：40-60mM KH₂PO₄，pH5.0-6.0；

流动相B：CH₃OH；

流速：1.0ml/min；

波长：260nm；

柱温：40℃；

洗脱方式：等梯度洗脱，A:B＝90:10。

所述的流动相A优选为50mM KH₂PO₄，pH5.5。

作为一种优选技术方案，从细胞中提取四种游离脱氧核苷酸的过程为：待细胞长满至T75后，胰酶消化收集细胞，PBS清洗细胞一次；加入0.3mM三氯乙酸，混匀后冰浴，然后离心吸取上清液，调节pH至5.0～5.5，上机检测前使用0.22um微孔滤头过滤。

进一步优选的，所述三氯乙酸的加入量为每10mg细胞沉淀加入100ul 0.3mM三氯乙酸，所述冰浴的时间为10min，所述离心的条件为12000g离心10min。用5mM氢氧化钾调节pH至5.5。

作为一种优选技术方案，所述标准曲线方程是将四种脱氧核苷酸的标准品溶液经高效液相色谱分析得到的。