[发明专利]一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，在利拉鲁肽中间体制备中，采用如下前导肽：

MATHAVSVLKGDGX₁VQGIINFEQHESNGX₂VKVWGSIHGLX₃EGLHGFHVHKFVNQHLCGX₄HLVALX₅LV，

X₁,X₂：为P和Y中的任何一个氨基酸；

X₃,X₄和X₅：为S,T和Y中的任何一个氨基酸。

2.一种重组表达载体，其特征在于：含有编码权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：通过将所述的编码基因克隆进入质粒载体pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)或者pET-39b(+)中获得重组表达载体pET-24a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)、pET-28a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)、pET-29a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)或pET-39b(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)。

4.一种包含权利要求3所述的重组表达载体的重组工程菌，其特征在于：采用所述的重组表达载体转入到大肠杆菌JM109(DE3)、HMS174(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta 2(DE3)中任意一种得到。

5.一种权利要求4所述的重组工程菌在重组利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)表达方面的应用。

6.一种利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成编码基因，所述编码基因编码权利要求1所述的融合蛋白；

2)将编码基因连接到表达载体中；

3)将带有编码基因的重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，构建重组工程菌；

4)利用抗性平板筛选含有目的基因质粒的重组工程菌；

5)重组工程菌发酵，诱导胞内不溶性包涵体形式的融合蛋白的表达，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

6)将菌体进行高压均质，收集包涵体，然后将包涵体经过洗涤和变复性；

7)酶切转化和分离纯化得到中间体多肽GLP-1(7-37)。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤2)中编码基因与表达载体的连接方式为通过Hind III/Xho I、Hind III/Nco I、Xho I/Eag I或者Sac I/Sal I酶切位点插入到质粒载体pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)或者pET-39(b)中的任意一种相应酶切位点中。

8.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中重组工程菌进行发酵培养，诱导表达所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。

9.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤6)中将洗涤后的包涵体在pH为7.5-14的碱性条件下，按照蛋白浓度为5-40g/L加入包涵体溶解缓冲液，进行包涵体溶解变性。

10.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤7)中所述酶切转化、分离纯化的具体方式为：步骤6)变复性后的融合蛋白经肠激酶酶解8-12h后即可得到中间体多肽、标签和连接肽的混合液，混合液使用离子交换分离即可获得纯度符合要求的中间体多肽样品。