[发明专利]一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法

说明书

本发明属于多肽制备方法技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽GLP‑1(7‑37)的方法。其主要步骤包括构建重组利拉鲁肽中间体工程菌，通过培养和诱导大肠杆菌表达GLP‑1(7‑37)融合蛋白，再经过变性、复性、酶切和分离纯化得到中间体多肽GLP‑1(7‑37)。通过改变前导肽序列，表达方式变为胞内不溶性包涵体表达，表达量显著增加；洗涤后的包涵体采用碱性溶解，无需使用大量的变性剂，以蛋白浓度为5‑40g/L的高浓度加入包涵体溶解缓冲液，变复性时间不超过1h，溶解后可以立即进行肠激酶酶切；减少复性工序，缩小酶切体系，降低化学试剂成本，有利于工业化放大；采用离子交换分离纯化，分离度高。本发明制备的利拉鲁肽中间体多肽GLP‑1(7‑37)达到92％以上，收率大于87％。

技术领域

本发明涉及基因工程及多肽制备方法技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法。

背景技术

糖尿病是由于遗传和环境因素相互作用，引起胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其中以高血糖为主要标志。临床典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。而近年来，随着生活水平的提高，饮食结构变化，大多数人动少坐多等因素，导致全球糖尿病发病率增长迅速。其中，1型糖尿病患者占10％，2型糖尿病患者占90％。

利拉鲁肽(Liraglutide)是一种通过基因重组技术生产的胰高血糖素样肽(GLP-1)类似物，与天然人GLP-1(7-37)具有97％的序列同源性，与天然的GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特性更适用于每天1次的给药方案。皮下注射给药后，其主要通过如下机理延长作用时间：一是通过自联作用使吸收减慢，二是与白蛋白结合，三是对DPP- Ⅳ和NEP具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。在2型糖尿病患者中，单次给予利拉鲁肽可以观察到胰岛素分泌率以葡萄糖浓度依赖的模式增加。目前国内利拉鲁肽完全依赖进口，价格昂贵，因此迫切需要提供一种利拉鲁肽的制备方法，为广大糖尿病患者带来福音。

利拉鲁肽作为胰高血糖素肽(GLP-1)类似物的代表药物之一，在美国和欧洲地区，它作为 2型糖尿病患者经二甲双胍单药或其他抗糖尿病口服药物治疗失败后的二三线药物使用。2013 年版中国2型糖尿病防治指南中规定将胰高血糖素(GLP-1)类似物作为三线治疗药物使用。利拉鲁肽的多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。

利拉鲁肽结构式如下：

NH₂-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(N-ε-( N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH

由以上结构式可知：利拉鲁肽分子式为C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，分子量为3751.20，是在天然GLP-1 分子结构上将第34位的赖氨酸Lys改为精氨酸Arg，并在26位增加了1条16碳棕榈脂肪酸 (N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))侧链而得到的衍生物。

利拉鲁肽最早由诺和诺德公司开发研制，通过基因重组技术，利用酵母生产获得。现有技术中中间体多肽GLP-1(7-37)的合成方法主要采用化学合成，如专利CN104045706B公开了使用多种大量有机溶剂，对于环境不友好，且步骤繁琐不利于大规模工业放大；工艺杂质多；总收率仅18％。