[发明专利]A19布鲁氏菌GroES缺失突变株构建及应用

权利要求书

1.A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)设计引物：分别依据布鲁氏菌A19全基因组序列中靶基因GroES的上、下游区域的核苷酸序列，各设计一对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度分别为545bp和628bp的同源性核苷酸片段；依据pK19mobsacB质粒的kana抗性基因，设计一对引物，扩增得到974bp的kana抗性基因片段；

所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端分别添加一个限制性内切酶识别位点及其保护性碱基；

2)目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的获得:以布鲁氏菌A19的基因组DNA为模板，分别在步骤1)设计的两对GroES基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段；依pK19mobsacB质粒为模板，在步骤1)设计的一对kana基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到两个同源性核苷酸片段；将扩增获得的GroES的上、下游同源性核苷酸片段和kana抗性基因片段采用PCR扩增的方法定向连接，构成GroES基因被kana抗性基因替换的同源性核苷酸片段；

3)将步骤2)获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入克隆载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体；

4)将步骤3)构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因GroES的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。

2.根据权利要求1所述的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)还包括依据kana抗性基因序列，在kana抗性基因的两侧设计一对特异性的引物，所述靶基因GroES的扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端分别添加kana抗性基因的上下游引物的反向互补序列，所述kana抗性基因的一对引物的5’-末端分别添加了布鲁氏菌GroES基因上游片段中下游引物和GroES基因下游片段中上游引物的反向互补序列。

3.根据权利要求2所述的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：以含有kana抗性基因的质粒为模板，在步骤1)设计的一对kana抗性基因的引物的引导下进行PCR扩增，得到kana抗性基因片段，所述定向连接为将GroES的上游同源性核苷酸片段、kana抗性基因片段、GroES的下游同源性核苷酸片段，采用PCR扩增的方法定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段。

4.根据权利要求2所述的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，GroES基因上下游设计的两对特异的PCR引物分别为GroESKan-N-F/GroESKan-N-R与GroESKan-C-F/GroESKan-C-R，其序列分别如SEQ ID NO.1-4所示；所述kana抗性基因的两侧设计的一对特异性的引物为GroESKan-F/GroESKan-R，其序列分别如SEQ ID NO.5-6所示。

5.根据权利要求1所述的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)还包括在GroES基因上游片段的外侧设计进行重组鉴定的上游引物GroESKan-I，其序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求3所述的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，其特征在于，所述含有kana抗性基因的质粒为pK19mobsacB质粒，所述克隆载体为PUC18。

7.用于构建A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的引物组，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO.1-7所示的引物。

8.根据权利要求1-6任一项所述的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法构建得到的A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株。