[发明专利]A19布鲁氏菌GroES缺失突变株构建及应用

说明书

本发明是关于一种A19布鲁氏菌GroES缺失突变株构建与应用，属于布鲁氏菌疫苗研究领域。通过设计GroES的上、下游区域及kana抗性基因的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度的同源性核苷酸片段及kana抗性基因，采用PCR扩增的方法将它们定向连接起来，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段，将获得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段连接入克隆载体中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体，将构建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重组载体转化布鲁氏菌A19，筛选阳性克隆，得到缺失目的基因的布鲁氏菌A19弱毒疫苗突变株。该疫苗突变株有望发展成为带标记的弱毒疫苗，对控制布病的流行、传播和国民经济的健康发展起到积极的促进作用。

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏菌疫苗研究技术领域，具体涉及A19布鲁氏菌GroES缺失突变株的构建与应用。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，可感染动物，牛、羊、猪、狗以及骆驼、鹿等动物。其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。该病进入慢性期可能引发多器官和系统损害。

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。布氏杆菌属有六种：马耳他布氏菌(羊型布氏菌)、流产布氏菌(牛型布氏菌)、猪布氏菌和狗布氏菌、林鼠布氏菌、绵羊布氏菌。其中引起人类疾病的有羊、牛、猪和狗布鲁氏菌。

为防治布鲁氏菌病流行，我国成功地研制出三种布鲁氏菌疫苗：羊种M5弱毒疫苗、牛种A19弱毒疫苗和猪种S2弱毒疫苗，并进行了大面积的推广应用，对牛、羊、猪、鹿等动物布病的防制起了巨大的作用。尤其是A19疫苗，即具有较M5低的毒力和副作用，又具有较S2疫苗高的保护力，得到了最广泛的应用。但是，现有布鲁氏菌牛种A19疫苗仍具有较强的毒力，不能用于孕畜及人，无特定的缺失标志，且免疫后所产生的各种血清反应和自然感染所产生的各种血清学反应极其相似，存在难以区分自然感染和疫苗免疫动物的问题。因此，迫切需要构建带缺失标记的弱毒布鲁氏菌疫苗，以提高疫苗的应用范围并能进行免疫动物和野毒感染动物的鉴别。

GroES基因是布鲁氏菌的毒力因子之一，长度为297bp。研究表明，GroES不但可以刺激T细胞引起细胞免疫，而且也是布鲁氏菌的免疫原之一，在细菌外膜囊泡中也存在，可能参与细菌间信息和物质的交换和调节。因此，本发明基于GroES基因，将布鲁氏菌A19疫苗株进行GroES基因的缺失，减弱其毒性并建立缺失标记，对控制布病的流行、传播和国民经济的健康发展起到积极的促进作用。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株及其构建方法和应用，所要解决的技术问题是通过基因敲除的方式制备布鲁氏菌A19疫苗株GroES基因缺失突变株，能够与非突变株感染进行鉴别,从而更加适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种A19布鲁氏菌GroES基因缺失突变株的构建方法，包括以下步骤：

1)设计引物：分别依据布鲁氏菌全基因组序列中靶基因GroES的上、下游己知区域的核苷酸序列，各设计一对特异的PCR引物，扩增目的基因上、下游两个长度为545bp至628bp的同源性核苷酸片段；两片段和后面扩增的974bp的kana抗性基因定向连接，构成缺失基因被kana抗性基因替换的同源性核苷酸片段。所述扩增上游片段的正向引物和扩增下游片段的逆向引物的5’端分别添加一个限制性内切酶识别位点及其保护性碱基，所述扩增上游片段的逆向引物和扩增下游片段的正向引物的5’端分别分别添加kana抗性基因的上下游引物的反向互补，依据kana抗性基因序列，在kana抗性基因的两侧设计一对特异性的引物，所述引物的5’-末端分别添加了布鲁氏菌GroES基因上游片段中下游引物和GroES基因下游片段中上游引物的反向互补序列；