[发明专利]烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法

说明书

本发明公开了烟草Mildew resistance locus O(MLO)基因MLO2，MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用及其方法，通过构建含有编辑MLO2，MLO6和MLO12三基因的多顺反子tRNA‑gRNA的编辑失活载体，将MLO2,MLO6和MLO12三基因编辑失活后，烟草表现出对白粉菌明显的抗性，研究结果对于研究植物对真菌的抗病免疫机制和培育抗白粉病的烟草品种有着重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及烟草MLO2、MLO6和MLO12基因在制备抗白粉菌烟草品种中的应用，还涉及制备抗白粉菌烟草品种的方法。

背景技术

白粉菌可以侵染超过650种的单子叶植物和9000多种双子叶植物，其危害影响极大，不仅对观赏类植物和水果产生了巨大的经济损失，也对许多农作物和经济作物带来了巨大的损失，严重影响了农业生产。目前，白粉病在我国各个地方均有发生，白粉病的危害呈现爆发范围大，侵染性广的特点。我国是当今世界上最大的烟草生产国，烟叶总产量和总销量都占有世界上30％左右。目前烟草税收已经占到我国财政收入的1/10，烟草已成为我国重要的经济植物。据不完全统计，我国每年烟草病害造成的直接经济损失在7亿元以上。而烟草白粉病(Erysiphe cichoracearum DC)是烟草生产上的主要病害之一，俗称“上硝”、“发白”或“下霜”。目前主要还是使用化学农药进行防治，而化学农药的使用，造成了烟叶中农药残留的增加，病害的抗药性增强和再猖獗，影响农业的可持续发展,并危及人类健康、破坏生态平衡。因此，通过选择和培育抗病的的品种是防治白粉病最安全和有效的方法。

目前在许多植物中，已经通过对MLO基因进行基因编辑或RNAi等方法，获得了抗白粉病的植株。而MLO基因的发现，是在1942年Fersileben和Leni在大麦的突变体中发现了完全抗大麦白粉病Blumeriagraminis f.sp.hordei(Bgh)的植株，使得白粉病的防治获得了重大突破。他们利用X射线处理大麦品种Haias，诱导其突变而产生了对Bgh的广谱抗病性，该抗性基因在70年代被遗传学家命名为Mildew resistance locus o(Mlo)。第一个野生大麦MLO 基因在1997年被克隆，为MLO基因功能研究奠定了良好基础。隐性突变的MLO基因赋予了大麦对白粉病的广谱抗病性。在MLO基因功能的研究中，一般认为MLO基因在植物抗病过程中起负调控作用，类似于植物的“感病基因”，任何感病的野生型(Mlo)都可以通过诱变获得对病原菌的广谱抗性。大麦mlo突变体发现已经超过70年，且25年前已经成功的应用于欧洲的农业生产，这表明在农业生产的条件下，MLO基因也表现出持久的抗病能力。目前，单子叶植物大麦和双子叶植物拟南芥都已获得到mlo突变体，它们均具有对白粉病菌的广谱抗性。不同的是，在大麦中MLO单基因的突变就可以表现出对白粉病的完全抗性，而在拟南芥中，共鉴定出15个MLO基因,其中与抗白粉病相关的的有AtMLO2、AtMLO6、 AtMLO12三个同源基因，这三个基因分别表现出对拟南芥白粉菌不同程度的抗性。Atmlo2突变体表现出对白粉病的部分抗性，双突变体Atmlo2与Atmlo6和Atmlo2 与Atmlo12对白粉病抗性增加，三突变体Atmlo2、Atmlo6和Atmlo12表现出对白粉病的完全抗性。

烟草中也存在MLO基因家族，但是烟草MLO同源基因数量众多，哪些基因的功能与对白粉病的抗性相关，目前没有相关研究数据。故对烟草MLO基因进行精准定点失活进而获得抗白粉病烟草育种素材更是未见报道。因此通过基因编辑的方法，在烟草中对NtMLO基因进行敲除，制作抗白粉菌品种的烟草素材，对于烟草抗病育种和理论研究具有重要意义。

发明内容