[发明专利]共编辑标记ben-1 sgRNA靶位点及其CRISPR/Cas9共编辑系统和应用

权利要求书

1.一种共编辑标记ben-1⁶⁴sgRNA靶位点，其特征在于，其靶DNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的共编辑标记ben-1⁶⁴sgRNA靶位点，其脱靶效应位点为5’-N₂₀NGG-3’其特征在于，所述脱靶效应位点的靶DNA序列5’-N₂₀-3’中3’端的12bp靶DNA序列与所述ben-1⁶⁴sgRNA靶DNA序列不匹配的碱基个数至少为1个。

3.根据权利要求1所述的共编辑标记ben-1⁶⁴sgRNA靶位点，其特征在于，其编辑效率大于或等于10％。

4.根据权利要求1所述的共编辑标记ben-1⁶⁴sgRNA靶位点，其特征在于，特异识别所述ben-1⁶⁴sgRNA靶位点的sgRNA质粒具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.一种高效的线虫CRISPR/Cas9共编辑系统，其特征在于，包含Cas9质粒、特异识别ben-1⁶⁴sgRNA靶位点的sgRNA质粒、特异识别目的编辑位点的sgRNA质粒、报告基因质粒、得到目的基因编辑所需的修复模板、雌雄同体线虫、普通线虫培养平板和浓度为14μMbenomyl的线虫培养平板，所述ben-1⁶⁴sgRNA靶位点具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述特异识别ben-1⁶⁴sgRNA靶位点的sgRNA质粒具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

6.应用线虫CRISPR/Cas9共编辑系统筛选杂合或纯合目的基因编辑线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

备料：准备Cas9质粒、特异识别ben-1⁶⁴sgRNA靶位点的sgRNA质粒、特异识别目的编辑位点的sgRNA质粒、报告基因质粒、得到目的基因编辑所需的修复模板、雌雄同体线虫、普通线虫培养平板和浓度为14μM benomyl的线虫培养平板，备用；

配制DNA混合液：将所述Cas9质粒、特异识别ben-1⁶⁴sgRNA靶位点的sgRNA质粒、特异识别目的编辑位点的sgRNA质粒、报告基因质粒和得到目的基因编辑所需的修复模板混合，得到DNA混合液；

显微注射：将所述DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到亲本P0代线虫，然后将所述P0代线虫置于浓度为14μM benomyl的线虫培养平板中培养，得到F1代线虫；

挑选共编辑的F1代线虫：从所述F1代线虫中挑选出ben-1⁶⁴sgRNA靶位点被编辑的线虫，其表型为生长良好、运动自如、运动轨迹如正弦曲线，将其单条置于所述普通线虫培养平板中培养，得到F2代线虫；

筛选具有目的基因突变共编辑的F1代线虫的平板：将生长到L4及以上时期的所述F2代线虫用线虫裂解液进行裂解，得到F2代线虫模板DNA，然后采用PCR扩增或酶切方法筛选出具有目的基因突变的线虫，找到具有目的基因编辑和ben-1⁶⁴sgRNA靶位点共编辑的F1代线虫平板；

去除ben-1⁶⁴sgRNA靶位点被编辑的线虫：从所述具有目的基因突变的F1代共编辑线虫的平板中挑选出8-16只F2代线虫，分盘至浓度为14μM benomyl的线虫培养平板，待F3代长至L4时期，筛选出不带共编辑突变的线虫平板，整盘线虫表型都为身体瘫痪、短小、运动不协调；

筛选纯合目的编辑的线虫：将所述不带共编辑突变线虫平板中的线虫制成DNA模板，通过分子生物学方法筛选出带有纯合目的基因突变的线虫平板。

测序验证纯合目的基因突变线虫是否正确。