[发明专利]共编辑标记ben-1 sgRNA靶位点及其CRISPR/Cas9共编辑系统和应用

说明书

本发明为一种基于ben‑1sgRNA靶位点的线虫CRISPR/Cas9共编辑标记位点及其共编辑系统和应用，涉及线虫基因编辑技术领域，更具体地说是一种利用ben‑1sgRNA靶位点在线虫中建立高效的CRISPR/Cas9共编辑系统及其在筛选目的编辑基因突变线虫的方法，本发明具有以下优点：(1)弥补dyp‑10等sgRNA靶位点，不宜对II号染色体上基因编辑进行共编辑标记的不足；(2)增加了线虫CRISPR/Cas9共编辑系统中可使用的共编辑标记sgRNA位点的数量；(3)使用ben‑1sgRNA做共编辑位点，被编辑后的线虫跟野生型线虫相比，生长更有优势，表型正常，便于挑选的同时，不影响生长状态，有益于快速高效的完成研究，节省了时间。(4)使用ben‑1sgRNA共编辑系统，与随机筛选相比，筛选效率提高25倍以上，工作量减少到1/5，大大节约了筛选时间。

技术领域

本发明涉及线虫基因编辑技术领域，更具体地说是一种利用ben-1基因的sgRNA靶位点在线虫中建立高效的CRISPR/Cas9共编辑系统，以及使用这个系统高效筛选包含杂合或纯合目的基因突变线虫的应用方法。

背景技术

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，以下简称线虫)是一种以细菌为食，生活在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它的特点有：(1)细胞数目固定，雌雄同体线虫全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；(2)有雌雄同体和雄性两种性别，既可以进行杂交又可以进行自交；(3)已完成了基因组测序；(4)生命周期短，25℃培养条件下整个生命周期仅为3天；(5)野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析；(6)繁殖能力强，成虫一生可产300个受精卵；(7)易于保存，可以用-80℃冰箱长期保存。目前，线虫作为一种经典的遗传学模式生物，由于具有生命周期短、基因组小、基因数目多、便于遗传操作、通体透明易于显微观察等优势，被国内外众多的科研机构作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有40-60％的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量保守的人类遗传疾病同源基因，所以，从理论上讲，只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的，就可能利用该模式生物来进行研究。

2013年以来，从细菌免疫现象中发现和发展的CRISPR/Ca9基因编辑技术由于其构造简单、易于操控和改造以及价格低廉等优势，迅速成为基因编辑领域的主要研究技术。CRISPR/Cas9系统最先于细菌中发现，是细菌抵御外界病毒感染的一种有效方式。CRISPR重复序列间有不同的间隔序列，表达出的RNA，可以通过碱基互补配对的方式指导Cas9蛋白特异地在外源入侵基因组上进行切割，从而阻断外源基因组的复制从而达到低于外源DNA入侵的目的。

在线虫的基因编辑中，CRISPR/Cas9共编辑系统是一种同时进行共编辑标记基因编辑和目的基因编辑的编辑系统。通常共编辑标记基因的编辑能产生易于识别的表型，收集这些发生了共编辑基因编辑的线虫，再从中筛选目的基因编辑的效率比直接筛选高。