[发明专利]一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用

说明书

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用；一种改良嵌合抗原受体T细胞，其特征在于所述T细胞在病毒转导过程中，将包括CAR在内的三种慢病毒同时转导入T细胞；对现有的CAR‑T细胞进行改造，同时将三种慢病毒共转导入T细胞，一方面既可以发挥CAR对肿瘤的特异靶向作用，并对肿瘤进行杀伤；另一方面，转导入细胞的IL‑7及IL‑15因子同样可促进CAR‑T细胞在体外的有效增殖，省去了实验过程中需多次加入IL‑7及IL‑15因子，简化实验步骤，并可减少CAR‑T制剂在制备过程中的成本。

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor)T细胞技术是不受免疫系统MHC的限制性，通过基因改造技术能够对肿瘤细胞特异靶向，从而对肿瘤进行杀伤的一种发展迅速的细胞治疗技术。自2017年FDA批准了诺华公司的Tisagenlecleucel以及Kite的Axicabtegene Ciloleucel两种CAR-T细胞产品上市以来，其分别用于治疗儿童和年轻人B细胞急性淋巴性白血病以及成人复发性或难治性大B细胞淋巴瘤，CAR-T免疫疗法在针对血液瘤涉及急性B淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤以及多发性骨髓瘤等的治疗方面取得了显著成效。并且美国医保与医助服务中心(Centers for Medicare and MedicaidServices,CMS)于2019年2月15日正式发布拟议决定备忘录：批准CAR-T细胞治疗正式纳入医保。这使得CAR-T疗法能够更快速的运用于临床，为患者带来福音。

据《2018年全球癌症统计数据》显示中国癌症的发病人数及死亡人数均为世界第一。肺癌、乳腺癌以及结直肠癌为全球发病率最高的三种癌症，而死亡率最高的则分别为肺癌、结直肠癌和胃癌。尽管CAR-T疗法在血液瘤中取得显著的进展，而其针对实体瘤的治疗特别是关于结直肠癌的治疗仍有待解决。

为了获得较好的临床结果，确保CAR-T回输制剂的质量尤为重要，包括CAR-T制剂的细胞量、病毒的转导效率等。这需要在体外培养过程中慢病毒能够高效转导，并且细胞能够有效的增殖。目前常用的促进CAR-T细胞扩增的因子有IL-2或是IL-7/IL-15。在naive T细胞被激活后，效应T细胞可分泌IL-2并且增加IL-2受体的表达，从而促进T细胞的增殖。目前IL-2已经是公认的促进T细胞增殖的细胞因子。但是其本身对体内存在的resting naiveT细胞及记忆T细胞的促增殖作用有限。IL-7可通过Jak-STAT通路及pI3K-AKt通路一方面抑制细胞凋亡，提高细胞存活；另一方面诱导周期蛋白的表达，促进细胞周期进展，从而促进naive T细胞及记忆T细胞的增殖。IL-15与其受体结合后主要通过JAK1/STAT3、JAK3/STAT5以及Ras/MAPK三条信号通路发挥作用，通过增生信号的增强以及凋亡信号的减弱，从而增加CD8+T细胞的免疫应答。

在CAR-T细胞制剂制备过程中，上述促进细胞增殖的因子常常是额外添加至T细胞的培养体系中。而市售重组人源化的IL-7因子1mg售价在4680美元，重组人源化的IL-15因子1mg售价在4000美元左右，在T细胞培养过程中，需要多次加入相应的因子，细胞因子的用量较大，极大提高了CAR-T细胞制备的成本，并且还需要确保不同批次细胞因子产品的质量。CN109055430A公开了一种共表达IL-18和CCL19蛋白及靶向MUC1基因CAR-T细胞的制备方法。可以在CAR的设计过程中加入IL-18及CCL19基因，从而使CAR-T细胞共表达IL-18及CCL19因子，既可促进T细胞增殖，也能募集更多的T细胞以及DC细胞至肿瘤组织一起杀伤肿瘤。尽管慢病毒载体能够稳定表达，但是其载体的容量小，最大只能容纳约8Kb的目的基因。而目前在CAR的设计过程中，除了特异性识别肿瘤抗原的抗体外，还包括诱导CAR-T死亡的自杀基因等。若再额外加入多个基因，则可能会超过慢病毒载体的容量，影响病毒包装。