[发明专利]全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法

权利要求书

1.一种全基因组结合靶向扩增建库方法，其特征在于，所述方法包括：

获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物，所述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域；

以所述接头连接产物为模板，采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物，其中所述第一基因特异性引物与所述目标区域结合，所述下游文库扩增通用引物与所述双链接头的第一链结合；和

以所述第一扩增产物为模板，采用第二基因特异性引物、所述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增，获得第二扩增产物，其中所述第二基因特异性引物与所述目标区域结合，所述上游文库扩增通用引物与所述双链接头的第二链结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标区域包括多个目标基因，所述第一基因特异性引物包括多个引物，分别与所述多个目标基因结合；所述第二基因特异性引物包括多个引物，为所述第一基因特异性引物的内侧巢式引物，分别与所述多个目标基因结合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二基因特异性引物包括与所述目标区域结合的部分和位于5’端且与所述双链接头的第二链相同或部分相同的部分。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链接头是双链鼓泡接头，所述第一链上包括样本标签序列，所述第二链中间部分包括一段与所述第一链不互补的序列形成的鼓泡结构。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR扩增的循环数是10至30个循环；所述第二PCR扩增的循环数是10至30个循环。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是疑似包含临床病原微生物的临床样品。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标区域包括目标耐药基因、毒力基因、病原体基因和遗传病相关基因中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头连接产物通过如下方法得到：

采用物理打断或酶切打断的方法将所述样品全基因组DNA打断成小片段；

将打断的小片段进行末端修复、加A碱基和磷酸化处理，再采用连接酶在片段两端连接所述双链接头得到所述接头连接产物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述小片段为200~400bp的小片段。

10.一种全基因组结合靶向扩增建库试剂，其特征在于，包括下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物，其中所述下游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第一链结合，所述上游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第二链结合，所述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物用于如下的全基因组结合靶向扩增建库方法：

获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物，所述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域；

以所述接头连接产物为模板，采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物，其中所述第一基因特异性引物与所述目标区域结合，所述下游文库扩增通用引物与所述双链接头的第一链结合；和

以所述第一扩增产物为模板，采用第二基因特异性引物、所述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增，获得第二扩增产物，其中所述第二基因特异性引物与所述目标区域结合，所述上游文库扩增通用引物与所述双链接头的第二链结合。