[发明专利]全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法

说明书

一种全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法，建库方法包括：获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物，其包括任选存在的目标区域和非目标区域；以接头连接产物为模板，采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增获得第一扩增产物，第一基因特异性引物与目标区域结合，下游文库扩增通用引物与双链接头的第一链结合；以第一扩增产物为模板，采用第二基因特异性引物、下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物，第二基因特异性引物与目标区域结合，上游文库扩增通用引物与双链接头的第二链结合。本方法富集目标区域，不影响非目标区域，检测成本低、效率高。

技术领域

本发明涉及测序检测技术领域，具体涉及一种全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法。

背景技术

病原体检测项目是医院、疾控中心、出入境检验检疫局、海关等单位经常会用到的技术。目前，常规病原检测一般是通过实时荧光定量PCR技术、细菌分离培养以及免疫组化等方法对未知病原进行检测，这类技术常常存在检测灵敏度不足、无法检测新型变异以及未知病原体，从而导致漏检，造成假阴性。二代测序技术由于其通量大，检测灵敏度高，能够同时检测已知和未知病原而受到检测机构的青睐。

目前市场形势是病原体检测仍然以常规病原检测手段为主，但是随着二代测序技术成本、通量以及时间等因素的不断优化，且市场对于精准医学的需求越来越强烈，二代测序技术在病原体检测领域必然越来越广。

传统临床病原微生物检测的主要方法是培养，其作为临床诊断的金标准具有操作简单、成本低廉、无需昂贵设备等优点，但培养的阳性检出率不高(30％～40％)，使用的培养条件不同会影响培养结果，而且部分微生物的培养时间较长，无法满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要。免疫学方法通过检测特异性的抗原或抗体确定是否感染某种微生物，实时荧光定量PCR技术(realtime fluorescence quantitative PCR，q-PCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新型定量分子检测技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。由于实时荧光定量PCR技术的扩增及分析等全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，同时该技术可以通过在同一体系中添加标记不同荧光基团的探针实现多重检测，因此实时荧光定量PCR技术是一种具有实时、准确、快速、简便等特点的分子检测技术。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)可检测几百种病原体，但依赖于培养增菌，无法检测原样品或培养失败的样品，另外该方法需要积累大量不同菌株的蛋白指纹图谱构建数据库，图谱数量及代表性、广泛性将直接影响检测的准确性。

常规病原检测技术的优势是费用低，检测时间短，在检测过程中有较为广泛的应用市场。但也存在明显的不足之处，即只能对已知病原体进行检测，而无法检测未知病原体，且检测灵敏度也有一定的限制。以最为常见的实时荧光定量PCR技术为例，针对腹泻样本的检测，仅能检测一些常见的致病菌、病毒和寄生虫，针对一些罕见和未知的病原存在漏检情况，这部分病原所占的比例并不低。另一方面，某些样品如粪便样品中的成分非常复杂，细菌含量多，而基于荧光定量PCR技术也存在检测的灵敏度不够的情况，导致病原被漏检。

发明内容

本发明提供一种全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法，检测成本低，检测效率高。

根据第一方面，一种实施例中提供一种全基因组结合靶向扩增建库方法，包括：

获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物，上述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域；

以上述接头连接产物为模板，采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物，其中上述第一基因特异性引物与上述目标区域结合，上述下游文库扩增通用引物与上述双链接头的第一链结合；和