[发明专利]利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法

权利要求书

1.利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对产冰核蛋白的重组大肠杆菌进行培养，以生产冰核蛋白；

发酵过程中，待重组大肠杆菌进入对数中前期，向发酵培养基中补加终浓度为0.1-0.5g/L的天冬氨酸；

产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001，其构建方法如下：

1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；

2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；

3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；

4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；

5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；

6)将步骤4)所得基因编辑片段和步骤5)所得CRISPR/Cas9基因编辑载体共同导入大肠杆菌BW25113中，得到重组大肠杆菌TDTC-inp001；

其中，步骤3)中用于PCR扩增所述knock-in-up和knock-in-down的引物分别如SEQ IDNO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示；

步骤5)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA作用位点的核酸序列为5′-TTGCACTATGCACAGCCAGC-3′；或者，

产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp004，其构建方法如下：

1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；

2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；

3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；

4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；

5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；

6)将步骤4)所得基因编辑片段和步骤5)所得CRISPR/Cas9基因编辑载体共同导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌TDTC-inp004；

其中，步骤3)中用于PCR扩增所述knock-in-up和knock-in-down的引物分别如SEQ IDNO:3、7和SEQ ID NO:6、8所示；

步骤5)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA作用位点的核酸序列为5′-TTGCACTATGCACAGCCAGC-3′；

具体地，利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法包括以下步骤：

(1)菌种活化；

(2)种子液的制备；

(3)发酵培养；

(4)发酵结束后将发酵液迅速降温至12-18℃，以激活所述冰核蛋白；

其中，步骤(3)还包括采用合适的碳源进行补料发酵；

步骤(1)具体为：从-80℃冰箱中取出菌种保存管，接种1-2环菌种，均匀涂布于活化斜面，24-37℃培养10-48h，然后转接第二代活化斜面，24-37℃培养10-48h；

所述活化斜面使用的培养基为SY固体培养基，其组成为：KH₂PO₄ 2-10g/L、MgSO₄·7H₂O0.2-2g/L、蔗糖5-30g/L、酵母粉1-10g/L、酵母蛋白胨1-10g/L、玉米浆干粉1-10g/L、琼脂粉10-30g/L，pH 6.0-7.5；

步骤(2)具体为：将步骤(1)活化的菌种接入SY液体培养基，24-37℃，150-300rpm震荡培养至OD₆₀₀＝3-10；

所述SY液体培养基的组成为：KH₂PO₄ 2-10g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2-2g/L、蔗糖5-30g/L、酵母粉1-10g/L、酵母蛋白胨1-10g/L、玉米浆干粉1-10g/L，消泡剂0.01-1g/L，pH 6.0-7.5；

步骤(3)具体为：将步骤(2)中制备的重组大肠杆菌TDTC-inp001的种子液按照5-20％v/v接种量接入发酵培养基中，开始发酵时，通入无菌空气，通气比0.5-3VVM；发酵过程中用氨水控制pH在6.0-7.5；温度维持33-37℃；溶氧维持在10-30％；当发酵培养基中的葡萄糖消耗完之后，以每升发酵液每小时3-8g的速度流加葡萄糖水溶液，控制残糖浓度低于0.1g/L，发酵周期40-48h；

其中，所述发酵培养基的组成为：K₂HPO₄ 2-18g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-8g/L，柠檬酸铁氨1-10g/L，葡萄糖10-20g/L，MgSO₄ 0.1-1g/L，K₂SO₄ 1-2g/L，锰和钼的无机盐；其中，锰离子终浓度0.1～1g/L，钼离子终浓度0.01～0.1g/L；或者，

步骤(3)具体为：将步骤(2)中制备的重组大肠杆菌TDTC-inp004的种子液按照5-20％v/v接种量接入SY液体培养基中，开始发酵时，通入无菌空气，通气比0.5-3VVM；发酵过程中用氨水控制pH在6.0-7.5；温度维持33-37℃；溶氧维持在10-30％；当SY液体培养基中的蔗糖消耗完之后，以每升发酵液每小时3-8g的速度流加蔗糖水溶液，控制残糖浓度低于0.1g/L，发酵周期40-48h。