[发明专利]利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法

说明书

本发明提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法。所述重组大肠杆菌是将冰核蛋白基因或冰核蛋白基因表达盒，通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的，且所述重组大肠杆菌中不含有抗生素抗性基因。本发明克服了现有冰核活性蛋白产生菌多为植物条件致病菌，对生态有潜在危害的缺点。采用本发明的发酵策略和方法生产的冰核活性蛋白产品具有活性高，生产方法操作简单、成本低廉、重复性好等优点，对环境无害，生产强度高，适用于稳定地大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及基因工程及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法。

背景技术

冰核活性细菌是一类能在低温条件下催化诱发植物体内水分产生冰核而引起霜冻的细菌。冰核活性细菌广泛附生于植物表面(尤其是叶面上)。正常情况下植物由于细胞中存在游离水，即使处于-7～-8℃的低温下也不结冰，而产生过冷现象；当冰核活性细菌存在时这种微生物作为最强的异质冰核因子，诱发冰晶的生成而使植物组织中失去了过冷的作用，进而引起对宿主植物的冻伤损害。冰核活性细菌是革兰氏阴性细菌，分属于假单孢菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)和黄单孢菌属(Xanthomonas)。冰核活性细菌的种类和数量受地理纬度、气候条件、植物种类及不同季节的影响和制约而在地球上存在着明显差异。我国幅员辽阔基本涵盖冰核活性细菌的种类，目前在我国发现的冰核活性细菌共有3个属17个种或变种。

对各种冰核活性细菌的研究表明，冰核活性细菌可以产生一种特殊的蛋白质--冰核活性蛋白，该蛋白是由inp基因编码的，经低温和一些营养因子诱导表达的一种与细胞膜结合的糖蛋白复合物，它具有类似冰晶的立体结构，因此可以充当模板的作用，促使冰晶提早形成。

由于冰核活性蛋白具有在较高温度下使水结冰的能力，近年来也被应用于人工造雪、食品冷冻干燥、冷冻浓缩等领域，具有十分广阔的市场前景。

高密度发酵是提升蛋白表达的重要途径，而生产工艺是控制蛋白产量及有效活性的重要影响因素。适宜的表达量和较高的活性，能够有效地提高生产效率和生产稳定性。然而，采用常规的高密度发酵蛋白方法生产冰核活性蛋白时，会出现冰核活性蛋白表达量过高、活性低，难以稳定生产的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种产冰核蛋白的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将冰核蛋白基因或冰核蛋白基因表达盒，通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的，且所述重组大肠杆菌中不含有抗生素抗性基因。

其中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌B系菌株或K12系菌株。所述冰核蛋白基因来自于具有冰核活性的革兰氏阴性菌，包括丁香假单胞菌(Psudomonas syringae)，或者泛菌属(Pantoea sp.)、黄单胞菌属(Xanthanmonas sp.)中的菌种。优选丁香假单胞菌。丁香假单胞菌冰核蛋白基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

第二方面，本发明提供产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001，其构建方法如下：

1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；

2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；

3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；

4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；

5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；