[发明专利]鉴定蜜柑大实蝇和橘大实蝇的特异引物对及其应用

说明书

本发明公开了一种鉴定蜜柑大实蝇和橘大实蝇的特异引物对及其应用。本发明设计了鉴定蜜柑大实蝇和橘大实蝇的特异引物对，并开发了基于常规PCR的分子鉴定技术。通过试验证明：本发明的基于常规PCR的分子鉴定技术可以实现对蜜柑大实蝇和橘大实蝇的种类鉴定，具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单、耗时短的优点。不仅解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残体的种类鉴定问题，也为蜜柑大实蝇和橘大实蝇的疫情监测、在我国柑橘主产区的分布及入侵现状、以及其后续的植物检疫及田间治理提供了实用技术和理论依据。对有效预防其进一步的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发展具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定蜜柑大实蝇和橘大实蝇的特异引物对及其应用。

背景技术

实蝇属双翅目实蝇科，在全世界广泛分布，约有500属4,500种，其中具有经济意义的实蝇有26属223种。实蝇的寄主范围广泛，在为害水果、蔬菜等经济作物的同时，也严重影响果蔬的对外贸易，造成贸易壁垒，导致巨大的经济损失。蜜柑大实蝇Bactroceratsuneonis和橘大实蝇B.minax是果实蝇属Bactrocera大实蝇亚属Tetradacus的2种寡食性实蝇，仅为害芸香科柑橘属Citrus的甜橙、酸橙、椪柑、温州蜜桔、柠檬、香橼、佛手，金橘属Fortunella的金桔，枳属Ponciru的枸橘等柑橘类作物。幼虫是为害柑橘的主要虫态，幼虫孵化后取食果肉，导致柑橘部分或全部果实腐烂并成糊状，使其完全丧失了食用价值和经济价值；或造成果实未熟先黄而脱落。幼虫的蛀果为害率一般为5-20％，局部地区可高达50％以上，甚至绝收。

橘大实蝇和蜜柑大实蝇的生活史均为1年1代，存在滞育现象，尚未实现实验室继代饲养以获得稳定的虫源，因此也制约了其生物学、生理生化、遗传学及防治策略等方面的研究。橘大实蝇主要分布在不丹、印度和中国的部分省份(重庆、广西、贵州、湖北、湖南、陕西、四川和云南)，而蜜柑大实蝇仅局限分布于日本和我国的少数省份(广西、湖南、四川、云南)，且被列为我国农业检疫性有害生物。基于CLIMEX地点比较模型与ArcGIS插值分析相结合的方法对其潜在地理分布的预测结果表明，我国所有的柑橘种植区域均为橘大实蝇和蜜柑大实蝇的中高度适生区。一旦大实蝇入侵到新的柑橘种植区域，将对柑橘产业造成灾难性的后果。随着气候变化、种植结构的调整和国际贸易的增加，其危害逐渐扩大，疫情呈逐年加重趋势，广东省怀集县已于2016年诱捕到蜜柑大实蝇，证实了其有进一步入侵扩散的趋势。

由于口岸截获的实蝇多为形态上极其近似的非成虫虫态，一般需经1-2周饲养为成虫后才能被准确鉴定，而蜜柑大实蝇和橘大实蝇经幼虫老熟化蛹到羽化更是需要5-6个月的时间，极大降低了检疫工作的时效性。传统的实蝇鉴定工作主要依靠形态学特征，而2种大实蝇的外部形态特征十分相似，仅能通过成虫中胸背板的鬃序(橘大实蝇有1对肩板鬃，前翅上鬃缺如；蜜柑大实蝇有2对肩板鬃和1-2对前翅上鬃)和雌虫的产卵器特征(橘大实蝇雌虫产卵器基节较长，长与第2-5腹背板长之和近等，末端略尖；蜜柑大实蝇雌虫产卵器基节较短，长约第4和第5腹背板长之和，末端三叶状)作为鉴定依据，这给2种大实蝇的形态学鉴定造成了极大困难。随着国际果蔬贸易的发展，实蝇类害虫传入我国的风险显著增加，其检疫鉴定特别是快速鉴定的需求愈发迫切。