[发明专利]一种全预混CYP2C9和VKORC1多重PCR基因多态性检测试剂盒和方法

说明书

一种全预混CYP2C9和VKORC1多重PCR基因多态性检测试剂盒和方法。本发明提供用于检测华法林相关CYP2C9基因*3与VKORC1基因‑1639两个位点核苷酸多态性的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒和方法，根据“等位基因特异PCR”原理，设计多重引物特异性PCR，在实时荧光定量PCR技术平台上实现两管反应同时检测华法林相关CYP2C9基因*3与VKORC1基因‑1639两个多态性位点的核苷酸类型。并采用修饰的Taq DNA聚合酶及在反应体系中加入二聚糖PCR保护剂，增加反应体系的稳定性，实现全预混检测体系保存的长期稳定性。

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于CYP2C9基因*3型与VKORC1基因-1639两个位点核苷酸多态性检测的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

华法林(Warfarin)属香豆素类口服抗凝血药，是用于治疗血液栓塞性疾病(如心脏瓣膜置换术后、心房颤动、静脉血栓形成及肺梗塞等)的一线药物。CYP2C9是华法林的主要代谢酶，其SNP的某些基因型会造成CYP2C9的酶活下降，以致华法林在体内的清除减慢。华法林是通过抑制维生素环氧化物还原酶(VKOR)，使维生素K参与的凝血因子II、W、IX、 X合成受阻，从而发挥抗凝作用，因此VKOR的一个重要亚单位基因(VKORCl)的SNP亦会造成个体对华法林的敏感性存在明显差异。加之华法林的治疗窗较窄，很少的剂量变化也可能导致血栓或出血，因此在临床应用上，相关基因的单核苷酸多态性检测可作为个性化治疗的给药依据。

目前研究发现，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林治疗剂量的影响逐渐被认识，其中VKORC1(-1639G/A)，CYP2C9*2(430C/T)和 CYP2C9*3(1075A/C)多态性位点与华法林治疗剂量关系最为密切，这些位点多态性都与华法林代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。目前，国际华法林实施协会根据VKORC1和CYP2C9基因多态性制定了详细的华法林剂量计算公式，从而可以实现患者个体化给药。

人CYP2C9基因具有遗传多态性，其中与亚洲人群最为密切的是CYP2C9基因的第c.1075位核苷酸存在A/C多态性。多态性位点为C时，其编码的多肽链第359位氨基酸Ile 被Leu取代，酶活性比野生型降低了80％。研究表明，临床常用的抗凝药华法林由CYP2C9 代谢，而其突变体使华法林代谢速率大大降低，用药个体在使用初期就有较高的出血危险性。人VKORC1基因具有遗传多态性，其编码的维生素K环氧化物还原酶是华法林的作用靶点。VKORC1启动子的基因多态性(-1639G/A)是影响华法林需求剂量个体差异的最主要因素。GG基因型的个体VKORC1启动子活性增高，引起VKORC1 mRNA表达增加，酶量的增多导致有活性的氢醌型维生素K生成和凝血因子生成也增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果；而启动子区域-1639G＞A的突变可引起VKORC1 mRNA的表达下降，从而使肝脏中酶的生成也相应地减少，进而引起环氧化型维生素K还原成氢醌型维生素K减少，此时只需要很少剂量的华法林就能达到抗凝效果，过量的华法林会导致溶血等严重副反应。

对CYP2C9*3和VKORC1多态性基因型进行分析，大多采用PCR-PFLP检测技术和 DNA直接测序法。由于PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。

发明内容

本发明针对现有技术检测CYP2C9*3型和VKORC1基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的CYP2C9*3 型和VKORC1全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒及方法。