[发明专利]一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法

权利要求书

1.一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、外植体的取材：取百子莲未开裂的小花苞进行消毒处理，切取小花梗外植体，将所述小花梗外植体切成小段；

S2、愈伤组织的诱导和继代培养：取小花梗外植体小段接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，然后，取带有残留小花梗组织的愈伤组织放置于愈伤组织继代培养基中进行继代培养；

S3、胚性愈伤组织的诱导：取经步骤S2培养后获得的不含残留小花梗组织的愈伤组织放置于胚性愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，其中，所述诱导培养的条件为：22~28℃暗培养，50~70 d；

S4、胚性细胞的继代保存：取经步骤S3培养后获得的胚性细胞放置在继代保存培养基中进行继代保存培养，所述继代保存培养基中含有麦芽糖和IAA，其中，所述继代保存培养基由4.43 g∙L^-1MS、1%蔗糖、1.8~2.2%麦芽糖、0.5 mg·L^-1 PIC、0.8~1.2mg·L^-1 IAA、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述继代保存培养基的pH为5.8；

步骤S2中，所述愈伤组织诱导培养基的组分由4.43 g∙L^-1MS、1.5~2.0 mg∙L^-1 PIC、2.5~3.5%蔗糖、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述愈伤组织诱导培养基的pH为5.8；

步骤S2中，所述愈伤组织继代培养基的组分由4.43 g∙L^-1MS、1.0~1.5 mg∙L^-1 PIC、2.5~3.5%蔗糖、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述愈伤组织继代培养基的pH为5.8；

步骤S2中，所述诱导培养的条件为：22~28℃暗培养15d；

所述继代培养的条件为：22~28℃暗培养，以50~70 d为一个继代周期，继代培养2次；

步骤S3中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组分由4.43 g∙L^-1MS、1.0~1.5 mg∙L^-1 PIC、2.5~3.5%蔗糖、0.6~1.0%琼脂以及水组成；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH为5.8；

步骤S4中，所述继代保存的条件为：放入2~8℃ 2~4 d后取出，22~28℃黑暗培养，30 d为一个继代培养周期。

2.根据权利要求1所述的提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，其特征在于，步骤S1中，所述百子莲为5~6月份花期、4~5年生的百子莲；所述小花梗外植体切成0.7~1.0 cm的小段。

3.根据权利要求1所述的提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，其特征在于，步骤S1中，所述消毒处理的步骤为：先用75%（v/v）乙醇处理50~70 s，用ddH₂O冲洗3~5次，然后用5%次氯酸钠消毒处理5~7 min，之后ddH₂O冲洗3~5次，再用75%乙醇处理50~70 s，用ddH₂O冲洗3~5次。