[发明专利]一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法

说明书

本发明提供了一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法，包括如下步骤：S1、外植体的取材：取百子莲未开裂的小花苞进行消毒处理，切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成小段；S2、愈伤组织的诱导和继代培养：取小花梗外植体小段接种于愈伤组织诱导培养基中诱导培养后，取带有残留小花梗组织的愈伤组织放置于愈伤组织继代培养基中继代培养；S3、胚性愈伤组织的诱导：取经步骤S2培养后获得的不含残留小花梗组织的愈伤组织放置于胚性愈伤组织诱导培养基中诱导培养；S4、胚性细胞的继代保存：取经步骤S3培养后获得的胚性细胞放置在继代保存培养基中继代保存。本发明优化了百子莲体胚发生体系，得到数量更多，性状更一致的百子莲胚性细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种提高百子莲胚性细胞继代效果的方法。

背景技术

百子莲‘Big Blue’(Agapanthus praecox ssp.orientalis‘Big Blue’)又名“蓝百合”、“非洲百合”，原产非洲南部，为单子叶多年生草本花卉，具有较强的观赏性。近半个世纪以来，百子莲在国际花卉业发展中脱颖而出，成为风靡全球的鲜切花、盆栽及地被花卉，并体现出极佳的观赏价值。此外，百子莲抗性极强，夏季可抗40℃以上的高温，冬季也可耐-10℃以下的低温，对土壤要求不严，且极少有病虫害发生，该物种在道路绿化、土壤修复领域也具有巨大的发展空间，目前市场上种苗供不应求。

百子莲在原产地南非常用种子或分株繁殖，但引种国内后存在发芽率低，繁殖周期长，繁殖系数低及后代易分化等缺点。体细胞胚胎发生途径具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高以及不受季节影响等优势，因此被认为是百子莲无性扩繁和种子保存的较佳途径。

国内百子莲进行体胚诱导的一般流程为：选择小花梗诱导出愈伤组织，通过继代培养诱导出胚性细胞，进而将培养基中的生长素去除继续培养胚性细胞，以利于诱导成熟胚胎并萌发为种苗。在百子莲的体胚体系中，一般利用特异性的外源生长素——毒莠锭(Picloram，PIC)作为调控胚性形成及体胚萌发的关键因子，极少使用其它激素。

体胚体系进行快繁的核心在于：利用植物体细胞全能性发育成完整的植株，而体细胞的载体——胚性细胞，可以通过不断继代培养得以扩增。诱导初期的胚性细胞通过继代，每月的增殖系数可以达到6～7倍，但胚性细胞多为单细胞外部起源，且数量较少，通常在胚性细胞阶段进行多次继代培养。而频繁继代会导致材料的同步化程度降低，增殖系数减少，通常在继代1年之后，增殖系数会降低到3倍左右，而且材料同步化状态较差，细胞团形态参差不齐，有成畸形胚的，也有衰败的。为解决频繁继代培养造成的体胚数量减少，以及工作量增加的问题，相关研究人员做了百子莲胚性细胞的超低温保存研究，旨在减少继代频次，同时能够很好维持胚性愈伤组织的胚性，从而利于后期的体胚苗诱导。但超低温保存技术要求相对较高，同时也会导致材料损失。因此，在百子莲胚性愈伤组织继代增殖的过程中，通过优化继代方法，得到状态良好，同步化形态一致的胚性细胞是百子莲体胚快繁的一个关键环节。

福建农林大学赖钟雄教授课题组通过不断优化，龙眼(Dimocarpus longan)胚性细胞继代时间可以达到20年以上。而百子莲胚性细胞继代保存的研究还处于初级阶段，相关研究并未见报道。