[发明专利]一种斯氏普罗威登斯菌酶剂的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种斯氏普罗威登斯菌酶剂的制备方法及应用，其以斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)CCTCC M 2017738为菌种，经菌悬液扩繁和降解酶剂超声破碎提取制备而得斯氏普罗威登斯菌降解酶剂。该降解酶剂可应用于于高效降解油菜、大白菜、紫菜苔、生菜、韭菜、黄瓜、番茄、辣椒、马铃薯、烟草等植物体中以及土壤和水体中的菌核净、烯菌酮和异菌脲。具有速效性好、环境友好、效果显著、成本低廉和易于推广等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术降解农药残留领域，特别是一种斯氏普罗威登斯菌酶剂的制备方法及应用。

背景技术

农药在农业病虫害综合治理中发挥着重要作用，但农药残留及其代谢产物已成为严重污染物，对人类健康和生态系统构成威胁。菌核净(Dimetachlone)，又称纹枯利，分子式C₁₀H₇Cl₂NO₂，其相对分子质量244.07，化学名为：N-(3,5-二氯苯基)丁二酰亚胺。在我国广泛用于油菜、大白菜、紫菜苔、生菜、韭菜、黄瓜、番茄、辣椒、马铃薯、烟草等作物上菌核病、纹枯病、赤星病等真菌病害的防治。尽管菌核净的杀菌活力前景看好，但由于健康问题，目前在美国和欧洲被禁止使用，但在一些发展中国家仍然广泛使用(如中国)。此外，以往的研究表明0.4mmol/L的菌核净是大鼠急性肾毒性物质，且其对哺乳动物内分泌具有干扰作用，对人体肾脏也有毒害作用。综上所述，农业中菌核净的大量使用会产生菌核净的暴露，这对人体健康和环境安全构成潜在威胁，消除菌核净污染物的生态友好和低成本策略迫切需要建立。

在许多国家，包括立法、农业标准化、农民教育和修复技术等多种措施来解决菌核净残留问题，虽然这些措施有助于去除农药残留，但菌核净均不能有效地去除。生物修复(Bioremediation)是一种利用活体微生物或来自微生物的酶对污染物进行解毒和降解，其具有操作简便、经济实用、环境友好等诸多优点的环境和经济有效的方法。迄今为止，尚无研究工作开展农产品中菌核净的生物降解。

发明内容

本发明针对菌核净降解技术缺乏，旨在提供一种高效降解菌核净的速效性好、环境友好、效果显著和成本低廉的斯氏普罗威登斯菌酶剂。

本发明的技术方案如下：

该斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)菌株的保藏编号为CCTCC M2017738，为现有菌株。本发明的技术方案是以斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)CCTCC M 2017738为菌种，经菌悬液扩繁和降解酶剂超声破碎提取制备而得斯氏普罗威登斯菌降解酶剂。

其中，所述斯氏普罗威登斯菌酶剂制备包括如下步骤：

1)菌悬液制备：无菌条件下加入2mL无菌磷酸盐缓冲液于培养48h的菌种培养皿中平行振荡，并用接种环轻轻刮落培养基表面的菌落，即成粗制菌悬液，将其转移到液体发酵培养基(牛肉膏8g/L、酵母膏14g/L、NaCl 5g/L)中在pH为7～8，30～35℃，150～200rpm条件下培养48h。将取出的发酵液立即在8000～10000r/min，3～4℃下离心10～15min，收集湿菌体，并用无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次。然后将无菌磷酸盐缓冲液与湿菌体混匀，控制菌体数量为≥6×10¹⁰cfu/mL。制得的菌悬液3～4℃保存备用。

2)降解酶剂提取制备：对步骤1)制得的菌悬液进行超声破碎提取游离酶，超声破碎时间10～15min，功率320W，每10s一个周期(工作5s，间歇5s)。破碎液在8000～10000r/min，3～4℃下离心10～15min，得上清液即制得降解酶剂。上清液游离酶含量控制在大于等于2.80mg/mL。

本发明的斯氏普罗威登斯菌酶剂可应用于高效降解油菜、大白菜、紫菜苔、生菜、韭菜、黄瓜、番茄、辣椒、马铃薯、烟草等植物体中以及土壤和水体中的菌核净。