[发明专利]一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法

权利要求书

1.一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于杂交步骤如下：

（1）避光培养催根：选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在25-28 ℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润；

（2）细胞周期同步化处理：取步骤（1）的根尖进行细胞周期同步化处理，获取中期相细胞，通过中期相细胞获得大量的中期染色体；所述细胞周期同步化处理：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500 mL的塑料盒子中，用2.0 mM 羟基脲溶液处理18 h；ddH₂O处理5 h；在2.5 μM 甲基胺草磷溶液中处理3 h，富集足够多的中期染色体；

（3）染色体悬浮液制备：用剪刀剪取步骤（2）同步化处理后的根尖部 0.5-1.5 cm；在4℃低温水浴锅中，用体积百分率2 %甲醛固定液固定20 min，Tris Buffer洗3次，5 min/次；然后，切1-1.5 mm根尖，每30个根尖放入装有500 μL LB01 缓冲液的2.0 mL的离心管中；用匀浆仪，18000 rpm匀浆15 s，然后用50 μm膜过滤，放4 ℃备用；

（4）斑茅基因组探针制备：配制20 μL荧光标记反应液，其中包含6 μL 0.1mM dNTP mixwith FITC，4 μL Nick Translation Mix，1.5 μg 斑茅基因组DNA，用ddH₂O补足至20 μL；反应液在15 ℃条件下反应5 h，即为含有FITC荧光标记的斑茅基因组探针；Badila基因组探针制备：配制20 μL无荧光标记反应液，其中包含6 μL 0.1 mM dNTP mix，4 μL NickTranslation Mix，1.5 μg Badila基因组DNA，用ddH₂O补足至20 μL；反应液在15 ℃条件下反应5 h，即无荧光标记的Badila基因组探针；

（5）变性处理：取步骤（3）过滤后的染色体悬浮液，在每管染色体悬浮液样品中加入200μL 去离子甲酰胺，混匀；在99 ℃水浴锅中变性5 min，然后转入冰水中处理10 min；配制杂交液：配制100 μL体系，50 μL FD，10 μL 20×SSC，斑茅基因组探针15 μL，Badila基因组探针15 μL，用水补足100 μL，混匀后，在99 ℃水浴锅中变性5 min，然后转入冰水中处理10min；

（6）染色体悬浮液原位杂交：取步骤（5）装有变性处理后染色体悬浮液样品的2.0 mL离心管，在每管样品中加入100 μL步骤（5）的杂交液；在37 ℃培养箱中，将样品放在旋转混匀仪上混匀、杂交；

（7）杂交完成后，用离心机5000 rpm离心8 min，去上清液；再加入500 μL LB01缓冲液用混匀仪震荡、混匀，重新悬浮染色体；取染色体悬浮液滴在玻片上，通过荧光显微镜，能检测到特异绿色荧光信号的，即为斑茅染色体。

2.根据权利要求1所述一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于步骤（1）所述避光培养催根，至根长为1-3 cm。

3.根据权利要求1所述一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于步骤（2）所述用羟基脲溶液和甲基胺草磷溶液处理，羟基脲溶液和甲基胺草磷溶液必须浸没根尖，且避光处理。

4.根据权利要求1所述一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于步骤（2）所述足够多的中期染色体，即细胞中期指数不低于40 %。

5.根据权利要求1所述一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于步骤（4）所述荧光标记反应液中FITC的荧光为绿色荧光。

6.根据权利要求1所述一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于步骤（4）所述基因组探针，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组探针的长度为100-800 bp。

7.根据权利要求1所述一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于步骤（6）所述样品放在旋转混匀仪上混匀，旋转混匀仪的1个循环参数为：首先，放样品的面板与地面平行，10 rpm旋转15 s；然后，放样品的面板与地面的夹角转至50°，进行幅度为1°- 2°的往复振动，持续5 s;最后逆时针转动到50°，并进行幅度为1°- 2°的往复振动，持续5 s；保持这样循环旋转、振动杂交6.5 h。