[发明专利]一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法

说明书

本发明涉及一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交（Genome in situ hybridization in suspension,GISHIS）的方法，包括细胞周期同步化、染色体悬浮液制备、基因组探针制备、样品与基因组探针变性、悬浮液中进行基因组原位杂交。滴片镜检，若悬浮液中产生绿色荧光信号，则判定为斑茅染色体，说明成功将绿色荧光标记到斑茅染色体上了。利用流式细胞仪，可以对染色体悬浮液中特异标记绿色荧光信号的斑茅染色体实现分选并进行相关测序研究，为研究复杂多倍体斑茅基因组提供了新的、有效可行的方法。本发明可应用于各种作物中属间杂交后代的染色体悬浮液中进行基因组原位杂交。

技术领域

本发明涉及一种作物属间基因组原位杂交的方法，具体涉及一种染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，属细胞生物学技术领域。

背景技术

甘蔗近缘属野生种具有丰富遗传多样性，蕴藏着大量可用于甘蔗遗传育种的优异性状。斑茅是甘蔗遗传改良育种中备受关注的近缘属野生种之一，甘蔗育种科技人员希望通过远缘杂交的方法将斑茅等近缘属野生种导入到甘蔗背景中来拓宽甘蔗的遗传基础。经过甘蔗育种家不懈的努力，已经获得了一大批甘蔗与斑茅的杂交后代，后代中有含斑茅染色体从一条到几十条不等的无性系材料。我们可以通过在染色体玻片上进行基因组原位杂交（Genome in situ hybridization, GISH）对甘蔗与斑茅杂交后代中斑茅染色体数目进行鉴定和统计，准确性非常高，因为在玻片上进行GISH的技术已经非常成熟了。

因为在甘蔗杂交育种上利用的斑茅为六倍体，2n=60，基因组庞大，直接测序无法组装到染色体水平，会缺失许多功能基因序列和重复序列，所以可通过流式细胞仪分选甘蔗与斑茅杂交后代中的斑茅染色体进行构建BAC文库、测序，把斑茅基因组进行分解研究。在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交，并把特异荧光标记在斑茅染色体上，是一个公认的技术难题。2005年，Ma等用热变性的方法初步在大麦染色体悬浮液中进行FISH，结果只能看到很弱的荧光标记信号。2013年，Giorgi等报道在小麦中染色体悬浮液中成功进行荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization in suspension，FISHIS），并利用流式细胞仪成功分选到特异标记的染色体。不过，这个技术局限于简单重复序列的探针，其他长的探针或基因组探针都无法杂交成功。然而，在染色体悬浮液中成功进行基因组原位杂交尚未见有报道。在染色体玻片上进行GISH时，37 ℃杂交过夜后，需要用盐溶液对非特异探针进行比较强的洗脱，所以要在染色体悬浮液上成功进行GISH，必须加入适量的盐溶液和去离子甲酰胺，以及适当的旋转速度、振动幅度，使这些因素协调才能在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，以填补在染色体悬浮液中无法进行基因组原位杂交的空白，突破技术难点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的一种在染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，其特征在于杂交步骤如下：

（1）避光培养催根：选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在25-28 ℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润；

（2）细胞周期同步化处理：取步骤（1）的根尖进行细胞周期同步化处理，获取中期相细胞，通过中期相细胞获得大量的中期染色体；所述细胞周期同步化处理：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500 mL的塑料盒子中，用2.0 mM 羟基脲溶液处理18 h；ddH₂O处理5 h；在2.5 μM 甲基胺草磷溶液中处理3 h，富集足够多的中期染色体；