[发明专利]一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法

说明书

本发明公开了一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法，涉及慢病毒检测技术领域，该引物对和荧光探针的组合中的引物对包括：SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物，荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该组合可以用于检测样品中的来自慢病毒的gag基因，通过对慢病毒的gag基因的检出实现对样品中慢病毒的检出，使用该组合检测慢病毒具有较高的特异性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及慢病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法。

背景技术

慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。

慢病毒载体作为一种有力的基因运载工具兼具多种优点，如基因的长期持续性表达；感染谱广；能够感染分裂期与非分裂期细胞和免疫原性相对较小等。虽然慢病毒载体可将目的基因稳定的整合到宿主细胞的基因组中，但是它们也可能对人的健康构成威胁，例如整合介导转化为可感染非靶细胞的具有复制能力的慢病毒(replication competentlentivirus)。美国食品和药品管理局(FDA)要求所有经逆转录病毒载体转导的细胞产品在使用该产品之前，都必须进行可复制病毒的检测。

常见的检测慢病毒方法存在一定的缺陷，如灵敏度低、特异性差。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合，该组合可以用于检测慢病毒的gag基因，使用该组合检测慢病毒具有较高的特异性和灵敏度。

本发明的另一目的在于提供一种快速检测慢病毒残留及可复制慢病毒的方法，该方法可以有效检测样品中的慢病毒残留及可复制慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。

本发明是这样实现的：

本发明提供的一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合，所述gag基因来自慢病毒，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述荧光探针一端标记有FAM荧光基团，另一端标记有TAMRA淬灭基团。

本发明提供的引物对和荧光探针的组合引物对和荧光探针的组合可以通过实时荧光定量PCR的方法，通过对gag基因的检测，实现快速准确的检测样本中慢病毒基因的拷贝数，判断样本的阴阳性，具有更高的灵敏度和特异性。

本发明提供的一种检测gag基因的方法，其包括：在PCR扩增体系中加入如上所述的引物对和荧光探针的组合；所述PCR扩增体系含有提取自待检样品的DNA模板。

优选的，PCR扩增的退火温度为55-65℃；优选的，退火温度为62℃。

优选的，在PCR扩增体系还添加有二甲基亚砜。

本发明的实验结果显示二甲基亚砜有助于提高引物探针的特异性和灵敏度，避免非特异性扩增。

优选的，二甲基亚砜在PCR扩增体系中的浓度为1-10％；

优选的，二甲基亚砜在PCR扩增体系中的浓度为3％。

优选的，所述荧光探针在PCR扩增体系中的浓度为：10-500pmol/ml；

优选的，荧光探针在PCR扩增体系中的浓度为380-420pmol/ml。