[发明专利]一种复合载网及其制备方法

说明书

本发明提供了一种复合载网及其制备方法。该复合载网包括一钼环作为支持基底，基底之上依次为导电胶、坐标铜网、方华膜、导电碳膜、氮化硅膜、导电碳膜。本发明所述复合载网具有良好的支持强度及导电性能，并可以提供样品中感兴趣区域的定位信息，因此可以成功实现IEM、STXM‑XANES以及Nano‑SIMS三种技术联用，对70‑100nm厚度电镜切片样品中的感兴趣区域进行蛋白信息、元素化学形态信息以及同位素信息的原位分析；同时可以降低IEM制样标记操作过程中破损的概率及程度，有效提高观察范围，实现STXM和Nano‑SIMS分析的准确定位，并大幅度提高Nano‑SIMS的检测效率。

技术领域

本发明涉及显微镜载网制备技术领域，尤其涉及一种复合载网及其制备方法。

背景技术

目前，新型药物在医学领域具有巨大的应用前景，可用于造影诊断、组织修复、光热治疗、药物载体等方面。目前研究结果表明，一般新型药物进入生物体内后主要会被网状内皮系统(肝、脾等)摄取，而一些经特殊修饰的新型药物则会靶向运输至特定组织(主要是肿瘤部位)。在不同的细胞微环境下，新型药物的理化性质会发生变化，经过复杂的降解及代谢过程，进而可能会造成不同生物效应。探明新型药物的这一系列体内行为，尤其是原位信息，对其在生物医学领域的安全性评价有十分重要的指导意义。

免疫电子显微镜(Immunoelectron microscopy,IEM)是利用对特定蛋白进行免疫标记(胶体金颗粒或铁蛋白)，在超微结构水平研究和观察，从而获取对其定位信息的一类电子显微镜技术，可用于观察新型药物在亚细胞水平的分布及形貌变化，研究其降解代谢相关蛋白的表达水平及分布信息。扫描透射X射线显微成像(Scanning transmission X-ray microscopy,STXM)技术将其30nm的高空间分辨率与近边X射线吸收精细结构(Nearedge X-ray absorption fine structure,NEXAFS)的高能量分辨率结合，可用于分析新型药物及其降解产物的原位化学形态及分布信息。纳米离子探针(Nano secondary ion massspectrometry,Nano-SIMS)是基于二次离子检测的具有纳米尺度分辨率的质谱成像技术，可用于原位分析新型药物的分布、同位素信息。

将以上三种技术联用可以对新型药物在组织细胞层面的原位化学形态及降解过程进行深入研究。然而由于三种技术对载网的要求有所不同，给实验的设计带来了较大困难。IEM与STXM所需的载网一般为镀有方华膜及碳膜的铜网；而Nano-SIMS则一般使用导电硅片。然而要实现三种技术对样品的原位分析，目前尚没有合适载网。

目前，与本发明最为接近的已有载网为一种坐标氮化硅窗格(品牌：中镜；货号：BSN100-A50MP2Q05；生产厂商：北京莱科百奥生物技术有限公司)，其窗格框架厚度为100μm，直径为3mm，中心窗格处厚度为50nm，窗格尺寸为500x 500μm，窗格中有栅格矢量分布的2μm的孔隙，其形貌图可见于图1。现有的坐标氮化硅窗格的主要缺点如下：

1)其中心氮化硅窗格下无支持系统，由于IEM制样需要进行复杂的免疫标记操作，过程中易造成中央窗格的破损，严重时整个氮化硅窗格框架会发生碎裂，以致部分窗格甚至样品切片脱落；

2)窗格尺寸为0.5x 0.5mm，可放置的生物切片量较少，相对降低了感兴趣区出现的概率，影响实验效率；

3)其坐标标记于边缘，对样品切片中感兴趣区进行定位时操作复杂且耗时较长；

4)进行Nano-SIMS分析时，由于中心窗格区域存在2μm的孔隙，造成对二次粒子信号检测的效率差异。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺陷与不足，本发明提供了一种复合载网及其制备方法，可以成功实现IEM、STXM-XANES以及Nano-SIMS三种技术联用，对70-100nm厚度电镜切片样品中的感兴趣区域进行蛋白信息、元素化学形态信息以及同位素信息的原位分析。