[发明专利]一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法

权利要求书

1.一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该方法应用到取样装置，所述取样装置包括壳体(1)，通道(2)，风机(3)，滤膜(4)，筛网(5)，其中壳体(1)围成一通道(2)，所述通道(2)具有两个端口，在所述两个端口处分别连接有风机(3)和滤膜(4)，在所述通道(2)中固定连接有若干筛网(5)；

其特征在于所述检测方法包括以下步骤：

1)将所述取样装置的壳体(1)、风机(3)、滤膜(4)、若干筛网(5)分别灭菌；将琼脂糖凝胶灭菌后降温至70℃，在无菌环境下将若干筛网(5)浸泡于灭菌后的琼脂糖凝胶中，取出筛网(5)在无菌环境下降至室温；

2)在无菌环境下组装所述取样装置；将所述取样装置移至待测地点，启动风机(3)，以恒定的风速运行1min；而后拆卸所述取样装置的滤膜(4)和筛网(5)，将所述滤膜(4)和筛网(5)浸泡于70℃的无菌水中，恒温保持1min，另取新鲜无菌水冲洗滤膜(4)和筛网(5)，合并洗液，再用新鲜无菌水定容至300mL，得到待测样品；

3)将所述待测样品离心取沉淀；分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；检测所述上清液中是否含有氨基酸序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。

2.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于步骤3)中所述检测是氨基酸序列测定。

3.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于步骤3)中所述检测包括以下步骤：对所述上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。

4.根据权利要求3所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于所述胰酶酶解包括以下步骤：将提取得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

5.根据权利要求4所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于所述二硫键还原剂是苏糖醇；所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。

6.根据权利要求3所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于还包括以下步骤4)：利用已知浓度的一组肺炎克雷伯氏菌溶液执行步骤3)，根据各组的生物质谱信号及其中的肺炎克雷伯氏菌浓度绘制标准曲线。

7.根据权利要求6所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于还包括以下步骤5)：执行以上步骤1)～步骤3)，而后将检测到的生物质谱信号代入到步骤4)所得的标准曲线中，计算得到所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度。

8.根据权利要求7所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于还包括以下步骤6)：根据所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度以及所述待测样品的体积计算得到所述待测样品中肺炎克雷伯氏菌的总量；根据步骤2)所述恒定的风速和所述运行时间计算流经所述取样装置的总风量；根据所述肺炎克雷伯氏菌的总量和所述总风量计算得到所述取样地点空气中肺炎克雷伯氏菌的浓度。

9.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于所述筛网(5)的孔径为170目；所述筛网(5)的数量为8个。

10.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于步骤2)中所述风速不超过8m/s。