[发明专利]一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法

权利要求书

1.一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于该方法选择了一种特异性抗人促卵泡激素受体抗体，通过人促卵泡激素与抗人促卵泡激素受体抗体竞争性结合人卵巢颗粒细胞表面的人促卵泡激素受体，使得孕酮含量产生变化，由此测定人促卵泡激素对人促卵泡激素受体的相对亲和力，该方法含有如下步骤：

（1）细胞复苏及传代

将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解；在超净台中将其移入离心管中，加入含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬细胞；800rpm离心5min后弃去上清，加入新鲜的细胞培养基，吹打混匀，移至细胞培养瓶中；瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次；

（2）细胞铺板

将处于对数生长期的人卵巢颗粒细胞使用胰蛋白酶消化后，弃去胰蛋白酶，加入含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基终止消化，并且重悬细胞；用细胞计数仪计数后调整细胞浓度；于100μl/孔细胞加入96孔细胞培养板中，37℃，5% CO₂条件下培养过夜；

（3）抗人促卵泡激素受体抗体与人卵巢颗粒细胞孵育结合

取一支抗人促卵泡激素受体抗体的无菌冻干粉末，用无菌PBS重悬，使其充分溶解，然后用含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基制备不同浓度的抗人促卵泡激素受体抗体，将上述抗人促卵泡激素受体抗体100μl与人卵巢颗粒细胞孵育1-5h，使其能够与人促卵泡激素竞争结合人卵巢颗粒细胞上的人促卵泡激素受体，其浓度范围为：0 .1-20000ng/ml；

（4）供试品人促卵泡激素竞争结合人卵巢颗粒细胞上的人促卵泡激素受体

使用含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基将人促卵泡激素供试品梯度稀释；将配制好的供试品加入至步骤（3）的96孔板中，使得供试品人促卵泡激素与抗人促卵泡激素受体抗体竞争结合人卵巢颗粒细胞上的人促卵泡激素受体，100μl/孔，37℃，5% CO₂条件下培养48小时以上；

（5）测定孕酮含量方法：

按照厂家为ALPHA DIAGNOSTIC的孕酮ELISA试剂盒的操作步骤，在包被好的96孔板中加入步骤（4）中的培养上清25-50μl，加入100-200μl/孔HRP连接酶，室温孵育60min；洗液洗涤3遍后，加入TMB 底物，100-200μl/孔，室温孵育20min后，每孔加入50-100μl的终止液；用酶标仪测定450nm处吸光度；利用SoftMax软件，分别计算自制品和参照药的EC₅₀值，比较其受体亲和力的一致性。

2.根据权利要求1所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（1）中所使用的细胞为人卵巢颗粒细胞，用于人促卵泡激素受体亲和力的测定。

3.根据权利要求1所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（2）中细胞铺板时，首先采用8%-12%的含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基培养过夜，使细胞迅速贴壁生长；之后更换为1%-5%的含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。

4.根据权利要求1所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于步骤（3）中采用培养基是浓度为1%-5%的含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。

5.根据权利要求1所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（4）中使用浓度为1%-5%的含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基将人促卵泡激素供试品梯度稀释。

6.根据权利要求1所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（4）中人促卵泡激素供试品的浓度范围：0 .001ng/ml-600ng/ml，稀释梯度为2-5倍，加样刺激细胞产生孕酮的时间为48-120h。