[发明专利]一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法

说明书

本发明公开了一种利用贴壁细胞‑人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)评价人促卵泡激素（hFSH）受体亲和力的分析方法。该方法选择了一种特异性抗人促卵泡激素受体（hFSHR）抗体，通过hFSH与抗hFSHR抗体竞争性结合KGN细胞表面的hFSHR，使得孕酮含量产生变化，由此可比较hFSH对hFSHR的相对亲和力。本发明的方法避免了使用同位素标价法所产生的放射危险以及流式细胞术繁琐的操作过程，可以稳定有效的测定hFSH对于hFSHR的相对亲和力。

技术领域

本发明属于蛋白质医药生物工程与技术领域，具体涉及一种通过hFSH与抗hFSHR抗体竞争性结合人卵巢颗粒细胞（KGN细胞）表面的hFSHR，使得孕酮含量产生变化，由此可测定hFSH对hFSHR的相对亲和力。

背景技术

人促卵泡激素（hFSH）是一种治疗女性不孕的重要药物，主要用于治疗女性无排卵性不孕症、控制性卵巢刺激和辅助生殖技术等。hFSH是一个异源二聚体的糖蛋白激素，由垂体前叶产生，其由一个α亚基和一个β亚基经非共价键连接。

人卵巢颗粒细胞（KGN细胞）是表达hFSHR的天然细胞，有文献报道通过流式细胞仪的方法确定KGN细胞表面的hFSHR表达情况，但是流式细胞术操作繁琐，分析检测的成本高，偏差较大，试验重复性低。也有文献报道采用同位素标记的 [¹²⁵I]hFSH竞争结合检测方法，来估算hFSH与KGN细胞特异性结合能力和水平；同位素标记法有放射性危害，对操作人员要求较高，通过估算的方式使测定结果的准确性存在较大复查。目前，亟需开发一种能够简单便捷、低成本、安全无风险的分析方法来测定人促卵泡激素受体亲和力。

发明内容

本发明人发现hFSH与KGN细胞膜上的人卵泡激素受体（hFSHR）结合后，激发环磷酸腺苷(cAMP)的信号传导通路，进而转录激活目的基因表达，激活芳香化酶，进而引起类固醇甾体如孕酮（progesterone）、雌二醇（estradiol）等的合成和分泌，通过检测hFSH刺激KGN细胞分泌到胞外的孕酮来评价hFSH的受体亲和力。若亲和力高，则hFSH与hFSHR的结合强，进一步可刺激下游通路的激发，从而增强hFSH的活性。

为确认KGN细胞对hFSH应答的特异性，以及自制品和参照药对KGN细胞表面的hFSHR的亲和力大小，选择了一种特异性抗hFSHR抗体（Human FSHR Antibody），将其与KGN细胞提前孵育，使抗hFSHR抗体与细胞表面hFSHR特异性结合，之后向细胞培养液中再加入hFSH，使得hFSH与抗hFSHR抗体竞争结合KGN细胞上的hFSHR，从而使得分泌到培养上清中的孕酮含量改变，由此可计算出hFSH对hFSHR的相对亲和力。

本发明提供了一种通过人促卵泡激素（hFSH）与抗人促卵泡激素受体（hFSHR）抗体竞争性结合人卵巢颗粒细胞（KGN细胞）表面的hFSHR，使得孕酮含量产生变化，由此可测定出hFSH对hFSHR的相对亲和力。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用KGN细胞评价人促卵泡激素（hFSH）受体亲和力的分析方法，该方法含有如下步骤：

（1）细胞复苏及传代；

（2）细胞铺板；

（3）抗hFSHR抗体与KGN细胞孵育结合；

（4）供试品hFSH竞争结合KGN细胞上的hFSHR；

（5）测定孕酮含量。

进一步地，具体操作步骤如下所示：

（1）细胞复苏及传代