[发明专利]一步洗涤磁珠法血液DNA提取试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。一种血液DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液；其特征在于，其中裂解液包含Tris、EDTA、NaCl、NaDC、十二烷基‑N‑甜菜碱、NLS、GuHCl、TritonX100、NH₄Cl、巯基乙醇；结合液包括异丙醇、PEG 8000、Brij 58；洗涤液包括GuHCl、Tris、乙醇、碳酸氢钠；洗脱缓冲液包括Tris、EDTA。申请通过配制含较高浓度的碳酸氢钠（碱性略强于醋酸钠和氯化钠）的洗涤液同时兼顾离子平衡和提供碱性的作用，并配合使用两性离子型去垢剂CHAPS，构建了仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。

背景技术

核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本。目前已知的酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于血液DNA提取的主要有吸附柱法和磁珠法，其中吸附柱法提取效果和所提取DNA浓度上都有明显不足，磁珠法属于固相抽提法，是采用磁珠为载体的分离技术。由于磁珠法提取核算操作简单，快速，重复性好，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。相比传统的DNA提取方法，磁珠法无需离心和大量检材，也无需接触酚/氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化操作，基于磁珠法的核酸提取具备传统DNA提取无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重要方向。

磁珠法在操作简易性（如CN201611240409、CN201810169271、CN201610848178、CN201110105238等的磁珠法提取DNA中均要经过2-4次不等的洗涤，不仅消耗时间，而且洗涤后吸取上清时需要较为精细的操作，容易产生污染/不适合实验室外现场操作）和提取效果上也有很多待改进之处，有必要开发一种操作更为简单的磁珠DNA提取方法以提高提取效率/满足筛查、法医调查等用途中现场快速处理样本的需要。

发明内容

在先前血液DNA提取试剂盒配方研究的基础上，申请人发现对洗涤次数难以减少的原因主要在于洗涤液较弱的碱性对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率问题，本发明的目的是提供一种仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。

为了实现上述的目的，本发明本申请提供了一种血液DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液；裂解液包含Tris 、EDTA、NaCl、SDS、CHAPS、NLS、GuHCl、月桂酸钠、NH₄Cl和巯基乙醇；结合液包括异丙醇、PEG 8000和Brij 58；蛋白酶K溶液包括蛋白酶K；洗涤液包括GuHCl、Tris 、乙醇、碳酸氢钠；洗脱缓冲液包括Tris和EDTA。

作为进一步改进，所述的裂解液包含Tris 50-100mM、EDTA 10-20mM、NaCl 0.5-1.0M、SDS 0.1%-0.8%、CHAPS 0.1-0.3%、NLS 0.5%-1.0%、GuHCl 65%-80%、CHAPS 1%-5%、NH4Cl 0.10%-0.30%、巯基乙醇 0.5%-2.0%，pH为7.0-8.5；

结合液包括异丙醇 65%-90%、PEG 8000 2%-10%、Brij 58 3%-5%，pH为7.0-8.5；

蛋白酶K溶液包括蛋白酶K 17-22mg/ml；

洗涤液包括GuHCl 2-7M、Tris 12-20mM、乙醇40%-60%、碳酸氢钠30-60mM,pH为8.5-9.0；