[发明专利]多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的方法在审
| 申请号： | 201910209767.8 | 申请日： | 2019-03-19 |
| 公开（公告）号： | CN109929912A | 公开（公告）日： | 2019-06-25 |
| 发明（设计）人： | 申阿东;王亚翠;王毅;焦伟伟;李洁琼;孙琳;肖婧;綦辉;申晨;徐放;祁雪;全舒婷 | 申请（专利权）人： | 首都医科大学附属北京儿童医院 |
| 主分类号： | C12Q1/6844 | 分类号： | C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京市众天律师事务所 11478 | 代理人： | 李新军 |
| 地址： | 100045 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肺炎支原体 扩增 恒温扩增 特异性扩增 传感检测 纳米生物 检测 特异性引物组合 假阴性结果 特异性基因 条件致病菌 致病菌 目的基因 灵敏度 假阳性 阴性 置换 | ||
1.一种多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物CP2；序列如SEQ ID NO:5所示的扩增引物C1和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，序列如SEQID NO:7所示的扩增引物D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2；其中在引物C1或者C2的5’端标记半抗原，在引物D1或者D2的5’端标记生物素；
(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
(4)使用纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在5’端标记半抗原的引物为C1，标记半抗原后的引物定义为C1*，在5’端标记生物素的引物为D1，标记生物素后的引物定为D1*。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述扩增引物C1*的5’端所标记的半抗原为荧光素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在结合垫、检测线及控制线区域依次包被有色基团修饰的亲和素化的高分子纳米粒子、羊抗FITC抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在64-66℃的环境中进行的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在65℃的环境中进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增的时间为30分钟。
8.一组用于恒温扩增肺炎支原体的P1基因的引物，其特征在于，所述引物包括：序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，序列如SEQ IDNO:3所示的交叉引物CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物CP2；序列如SEQ ID NO:5所示的扩增引物C1和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2；其中在引物C1或者C2的5’端标记半抗原，在引物D1或者D2的5’端标记生物素。
9.根据权利要求8所述的引物，其特征在于，所述在5’端标记半抗原的引物为C1，标记半抗原后的引物定义为C1*，在5’端标记生物素的引物为D1，标记生物素后的引物定为D1*。
10.根据权利要求9所述的引物，其特征在于，在所述扩增引物C1*的5’端所标记的半抗原为荧光素。
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