[发明专利]多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测肺炎支原体的方法

说明书

本发明公开了一种多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法能够针对肺炎支原体P1基因进行特异性扩增，本发明还提供了用于上述恒温扩增方法的特异性引物组合。本发明提供的多交叉置换扩增方法可以在30分钟内完成整个MCDA扩增，在其对肺炎支原体的特异性基因P1的检测中，检测下限可以低至10fg，具有非常高的灵敏度。另外，本发明提供的扩增方法具有很高的扩增特异性。在对常见的致病菌、条件致病菌及非肺炎支原体DNA的检测中，均为阴性扩增，只有肺炎支原体呈特异性扩增，说明所建立的方法具有极高的特异性，能准确地鉴定肺炎支原体，无假阳性及假阴性结果产生。

技术领域

本发明公开了一种应用恒温扩增技术检测目的基因的方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是人类呼吸道感染性疾病最常见的病原体之一，也是社区获得性肺炎的主要病原体。在MP流行时期，由MP引起的社区获得性肺炎在一般人群中约占20％-40％，而在封闭人群中可高达70％。MP感染可发生在各年龄段人群中，其中以学龄期儿童和青少年最为常见。MP感染引起的临床症状多种多样，轻者临床表现与其他病原体感染引起的非特异性症状类似，如发热、咳嗽、流涕等；重者可表现为重症肺炎、呼吸衰竭等严重的呼吸系统疾病，甚至累及中枢系统、消化系统等。β-内酰胺类药物作用于细胞壁，是呼吸道感染性疾病经验性治疗常选药物，然而MP缺乏细胞壁，因此对作用于细胞壁的药物天然耐药。因此研发一个可用于诊断MP感染的简单、快速、敏感性和特异性较高的MP检测方法，对合理应用抗生素，有效治疗MP至关重要。

目前用于MP感染诊断的MP检测方法主要有：培养法、血清学检测、分子生物学检测。培养法是MP检测的金标准，但是该种方法并不推荐用于MP检测，因为MP对生长条件要求苛刻、实验室要求比较高、技术人员要求比较严格，并且MP生长缓慢，需2-4周才可以获得培养结果。血清学检测因其便利性、敏感性和特异性较好而广泛用于实验室检测，但是血清学检测受采样时间，患者年龄、机体免疫状态等因素的影响，同时血清学检测结果的可靠性依赖急性期和恢复期双份血清的获取，由于恢复期血清难以获取，因此限制了血清学检测在临床上的应用。随着分子生物学技术的发展，以PCR为基础的核酸检测技术开始广泛用于MP检测，其中Real-time PCR是目前临床常用的MP快速检测技术。但是该检测方法依赖精密复杂的仪器，昂贵的探针，对实验室条件和技术人员要求比较高，因此该检测方法不适用于基层医院。

近年来为了克服PCR检测的不足，以恒温扩增技术为基础的核酸检测技术迅速发展。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，仅需要水浴锅或简单的PCR仪即可，并且恒温扩增核酸检测技术具有特异性和敏感性高、操作简单、反应迅速的优点，因此恒温扩增技术可广泛用于各医疗机构。迄今为止，恒温扩增技术已有10余种，目前应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温扩增技术依赖多种酶同时工作，试剂昂贵、操作复杂，在欠发达地区及快速检测技术领域不适合推广应用。为克服PCR技术和现有的恒温扩增技术的劣势，实现简单、快速、灵敏、特异的核酸检测，发明人近期新建了一种核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplication,MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。