[发明专利]一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法

权利要求书

1.一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)脑心通制剂总DNA的提取：用蛋白酶K消化制剂中动物组分，按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分；得总DNA的提取物；

(2)PCR扩增：反应体系为15μL，脑心通制剂总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl₂溶液1.5μL，2.5mM dNTPs 1.2μL，地龙特异性引物：10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH₂O 8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃或58℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述地龙特异性引物包括3个引物对，序列如下：

COI Metaphire F2/R2：COI Metaphire F2：5’-TTAGTGTCGTCCGCCGCAGTT-3’，COIMetaphire R2：5’-CTACTGCCCACACAAATAGTGGG-3’，扩增片段长度为232bp；

COI AA F2/R1：COI AA F2：5’-CTTGGAAGAGATCAGCTATAC-3’，COI AA R1：5’-CTAAAATTGATGAGGCACCC-3’，扩增片段长度为337bp；

COI AA F3/R1：COI AA F3：5’-TTTGGAAACTGACTGCTCCCA-3’，COI AA R1：5’-CTAAAATTGATGAGGCACCC-3’，扩增片段长度为247bp；

其中，所述3个引物对中，COI Metaphire F2/R2引物对是针对地龙的Metaphire属设计的特异性引物，该属对应通俗环毛蚓和威廉环毛蚓；COIAA F2/R1和COI AA F3/R1引物对是针对地龙的Amynthas属设计的特异性引物，该属对应参环毛蚓和栉盲环毛蚓；

(3)电泳检测及测序：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳，得单一明亮条带，纯化，测序；

(4)鉴定：将步骤(3)中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种；

对于同一待测样品，地龙正品应同时满足以下2个条件：

A在电泳检测时，待测样品的电泳检测条带与3个引物对中任意一对对应；

B测序后进行BLAST判定，与其相似性最高的序列对应的物种需与将其扩增出条带的引物对对应的物种一致。

2.一种脑心通制剂中Metaphire属地龙药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)脑心通制剂总DNA的提取：用蛋白酶K消化制剂中动物组分，按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分；得总DNA的提取物；

(2)PCR扩增：反应体系为15μL，脑心通制剂总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl₂溶液1.5μL，2.5mM dNTPs1.2μL，地龙特异性引物：10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH₂O 8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，58℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述地龙特异性引物序列如下：

COI Metaphire F2/R2：COI Metaphire F2：5’-TTAGTGTCGTCCGCCGCAGTT-3’，COIMetaphire R2：5’-CTACTGCCCACACAAATAGTGGG-3’，扩增片段长度为232bp；

(3)电泳检测及鉴定：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳，得单一明亮条带，判定待检制剂中的地龙为通俗环毛蚓或威廉环毛蚓。