[发明专利]一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法

说明书

发明公开了脑心通胶囊地龙药材的DNA分子鉴别方法。本方法采用蛋白酶K消化动物药组分，广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取胶囊中的植物药组分。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ设计3对地龙特异性引物进行PCR扩增；将产物电泳检测测序，所得序列在GenBank数据库中用BLAST进行判定，以相似性最高的序列对应物种为最接近物种。本发明的地龙特异性引物可扩增200‑350bp的小片段基因，不受地龙的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的优点。本方法可针对含地龙细粉的中药制剂进行地龙成分鉴定，填补了脑心通胶囊在地龙质量控制方面的空白，提高了该药的质量控制水平。

技术领域

本发明涉及一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法。

背景技术

脑心通胶囊为陕西步长制药有限公司独家单一品规的中药品种(国药准字Z20025001，规格：每粒装0.4g)，是由黄芪、丹参、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、醋乳香、醋没药、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、水蛭、全蝎等16味中药直接散粉制药而得，其功能主治益气活血，化瘀通络。用于气虚血滞、脉络痹阻所致中风，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短，脑梗塞、冠心病心绞痛的治疗。

地龙作为脑心通胶囊的臣药之一，功能主治清热定惊，通络，平喘，利尿。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少。据2015年版《中国药典》(一部)记载，地龙(Pheretima)来源为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”。

在我国，地龙的原动物蚯蚓品种繁多、形态相似，因此地龙药材品种来源复杂，市场上品种混杂和掺假现象也较为普遍，最常见的伪品有大腔蚓Metaphire magna(Chen)、暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus(Chen)等。地龙药材的传统鉴别主要以基原、性状、显微和薄层鉴别为主，专属性和特异性都不强，对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强，一般人难以区分；同时传统方法也存在局限性，特别是药材加工切断或粉碎制成中药制剂后，性状特征消失，难以满足实际工作需求。就脑心通胶囊而言，目前尚未有研究报道该胶囊中地龙的有效鉴别方法，2015年版《中国药典》(一部)中也未对脑心通胶囊中地龙的质量控制进行规定。

因此，在尚不能明确其他蚯蚓物种能否应用于临床的情况下，急需建立准确、方便、通用的鉴定方法来确保地龙药材的正品基原，加强对脑心通胶囊的监管与质量控制，以保证临床用药安全。

随着分子生物学领域的迅速发展，DNA条形码分子鉴定技术应运而生，被广泛应用于市售中药材的鉴定。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，在动物类中药材中采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为主体序列，ITS2为辅助序列。近年来，国内许多研究者探讨了应用CO Ⅰ、12S rRNA、16S rRNA和Cyt b等基因序列对蚯蚓进行分类鉴别的可能性，结果表明CO Ⅰ、12SrRNA和16S rRNA基因可以在不同程度上有效鉴定蚯蚓种类，以判定地龙药材的正伪。

但上述研究多以CO Ⅰ、12S rRNA和16S rRNA基因的通用引物对药材DNA进行PCR，扩增的目的产物片段大小在350～700bp左右。然而，就脑心通胶囊而言，在地龙药材的制作(晒干)、加工(粉碎)和保存过程中不免发生DNA的降解，基因裂解为小片段，不能被上述通用引物扩增出来；此外，除地龙外，脑心通胶囊中还含有水蛭和全蝎两种动物药，也可以被上述通用引物扩增出与地龙相似大小的基因片段。因此，设计能扩增出小片段基因的地龙特异性引物，对于脑心通胶囊中地龙基原正品的鉴定显得尤为重要。

发明内容