[发明专利]一种人血清25-羟基维生素D的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种人血清25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将人血清样本与0.5-1.5mol/L氢氧化钠水溶液混合，混匀后进行超滤离心得到超滤液；

2)将步骤1)超滤液加入25-羟基维生素D同位素内标溶液，二者体积比为8-20:1，混匀后加入甲基叔丁基醚，混匀后离心取上清液；

3)将步骤2)所述上清液进行氮气吹干，加入复溶液，混匀得到待测样品；

4)将步骤3)所述待测样品进行高效液相色谱串联质谱检测，得到人血清25-羟基维生素D的检测结果，与校准品建立的标准曲线进行比对，得到相关含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中氢氧化钠溶液浓度为1mol/L，人血清样本与所述氢氧化钠水溶液的体积比为20-30:1。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中所述超滤方法中超滤膜为cutoff 3kDa，25℃，1800g，离心时间20-40min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)所述25-羟基维生素D的同位素内标是浓度为1μg/mL的d6-25-羟基维生素D3的甲醇水溶液。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的甲醇与水体积比为2-10:1。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述复溶液为甲醇水溶液，甲醇与水体积比为2-10:1。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件：

高效液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件为：

色谱柱Phenomenex Kinetex C18 Column4.6x50mm,2.6μm,

色谱柱柱温25℃；

进样量30μL；

流速1.0mL/min；

流动相流动相A为含0.2％甲酸的水，流动相B为含0.2％甲酸的甲醇；

所述梯度洗脱的条件如下：

时间流速A流动相B流动相

所述质谱检测为正离子模式，并采用多反应监测MRM的扫描方式，所述多反应监测MRM的参数如下，

电离源为大气压化学电离APCI源；

喷雾气压力为60psi，

温度为550℃，

电晕针电流为5μA，

气帘气为30psi，

碰撞气为5psi。

8.一种应用权利要求1所述检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括校准品、质控品、同位素内标溶液、浓度为1mol/L氢氧化钠水溶液、甲基叔丁基醚、0.2％的甲酸水溶液、0.2％的甲酸甲醇溶液、80％甲醇水溶液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的5种浓度依次都为5、10、25、50、100ng/mL的牛血清白蛋白水溶液，所述牛血清白蛋白的质量分数5％。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的2种浓度分别依次为7.5、15和15、30ng/mL的牛血清白蛋白水溶液，所述牛血清白蛋白的质量分数5％。