[发明专利]一种人血清25-羟基维生素D的检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测人血清中25‑羟基维生素D(25OHD)的检测方法及试剂盒，包括以下步骤：血清样品与氢氧化钠水溶液混匀，进行超滤离心后，在超滤液中加入25‑羟基维生素D的同位素内标溶液，充分混匀后，加入甲基叔丁基醚溶剂后进行涡旋震荡萃取；离心后，取上清液并进行氮气吹干，复溶后得到待测样品，而后进行检测，本发明检测方法前处理简单，特异性和抗基质干扰能力强，检测精密度和准确度高，检测灵敏度高。

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种检测人血清25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱法。

技术背景

维生素D的检测量每年都在以指数形式增长，造成这种需求的原因主要是在全球不同人口中维生素D的缺乏率很高和研究发现维生素D在人体很多生理功能中有很重要的作用。如能促进饮食中钙和磷酸盐的吸收和增强骨骼矿物质密度，因此能促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼的强度。此外，维生素D还与心血管疾病、自身免疫疾病、糖尿病和恶性肿瘤等疾病密切相关。维生素D的缺乏可导致骨骼发育受损，以及上述疾病的发病风险增加。

维生素D是一类脂溶性维生素，在人体内主要有两种形式存在：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)，其中维生素D2是通过膳食途径摄入的，如酵母或真菌类食物，而维生素D3则大部分是人体经光照将皮肤中的7-脱氢胆固醇转化得到的，但也能通过饮食获得，如鱼、鱼肝油或蛋黄等食物。维生素D在肝脏中可转化为25-羟基维生素D，从而被机体转运或储藏，另外25-羟基维生素D在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此25-羟基维生素D可作为一类主要的生物标志物用于体现人体维生素D的营养水平。

目前，25-羟基维生素D的检测方法有多种，包括免疫检测、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等。其中，由于25-羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此在检测时存在严重的基质干扰，而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰，对比而言，LC-MS/MS具有特异性强、精密度和准确度高等特点，被认为是评价机体维生素D营养状况的金标准方法。

发明内容

针对上述技术问题，发明人提供了一种人血清25-羟基维生素D的检测方法，包括以下步骤：

1)将人血清样本与0.5-1.5mol/L氢氧化钠水溶液混合，混匀后进行超滤离心得到超滤液；

2)将步骤1)超滤液加入25-羟基维生素D3同位素内标溶液，二者体积比为8-20:1，混匀后加入甲基叔丁基醚，混匀后离心取上清液；

3)将步骤2)所述上清液进行氮气吹干，加入复溶液，混匀得到待测样品；

4)将步骤3)所述待测样品进行高效液相色谱串联质谱检测，得到人血清25-羟基维生素D的检测结果，与校准品建立的标准曲线进行比对，得到相关含量。

优选地，本发明进一步提供一种检测方法，所述步骤1)中氢氧化钠溶液浓度为1mol/L，人血清样本与所述氢氧化钠水溶液的体积比为20-30:1。

优选地，本发明进一步提供一种检测方法，所述步骤1)中所述超滤方法中超滤膜为cutoff3kDa，25℃，1800g，离心时间20-40min。

可以把分子量大于3000的大分子化合物(包括蛋白质)移除掉，保证超滤液中只存在一些小分子化合物,进一步降低试验中的蛋白质干扰。

所述方法中使用的校正品优选校准品为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的5种浓度依次都为5、10、25、50、100ng/mL的牛血清白蛋白水溶液，所述牛血清白蛋白的质量分数5％。

优选地，本发明进一步提供一种检测方法，所述步骤2)所述25-羟基维生素D的同位素内标是浓度为1μg/mL的d6-25-羟基维生素D3的甲醇水溶液。