[发明专利]一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法

权利要求书

1.一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)脑心通制剂总DNA的提取：先用蛋白酶K消化动物组分，再按照广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分，得总DNA提取物；

(2)PCR扩增：以步骤(1)所得总DNA提取物作为模板，进行PCR扩增；反应体系为15μL，其中总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl₂溶液1.5μL，2.5mM dNTPs1.2μL，特异性引物为10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH₂O8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述特异性引物包括3个引物对，序列如下：

COI WP F1/R2序列：COI WP F1：5’-TTGGTGGGTTTGGTAATTGAC-3’，COI WP R2：5’-GATGGGCCTGAATGAGATACG-3’，扩增片段长度为202bp；

COI WP F2/R2序列：COI WP F2：5’-TGGGTTTGGTAATTGACTC-3’，COI WP R2：5’-GATGGGCCTGAATGAGATACG-3’，扩增片段长度为198bp；

COI HN F1/R2序列：COI HN F1：5’-GCCATTAATAGTTGGAGCAG-3’，COI HN R2：5’-CGGATATAATGTTCATCCAGC-3’，扩增片段长度为142bp；

(3)电泳检测及测序：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳20-30min后，得单一明亮条带，纯化后测序；

(4)鉴定：步骤(3)中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行对比，相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中蛋白酶K消化动物组分的步骤为：取脑心通制剂细粉，加缓冲液AP1和蛋白酶K，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的10×PCR缓冲液的组成包括：750mM Tris，PH值为8.8；200mM(NH4)₂SO₄；15mM MgCl₂；0.1％(v/v)Tween20。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，COI WP F1/R2和COI WPF2/R2引物对是针对水蛭Haemopidae科设计的特异性引物，包括蚂蝗Whitmania pigraWhitman和柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman；COI HN F1/R2引物对是针对水蛭Hirudinidae科设计的特异性引物，包括水蛭Hirudo nipponica Whitman。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)的鉴定具体方法为：对于同一待鉴定样品，同时满足以下2个条件才可鉴定为含有水蛭正品；

(1)在电泳检测时，待测样品出现与3对水蛭特异性引物对中任意一对的目的条带大小一致的条带；

(2)测序后进行BLAST，与其相似性最高的序列对应的物种需与将其扩增出条带的引物对对应的物种一致。

6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于：所述水蛭为2015年《中国药典》(一部)收载的蚂蝗Whitmania pigra Whitman；或柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman；或水蛭Hirudo nipponica Whitman。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的脑心通制剂为脑心通胶囊。