[发明专利]一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法

说明书

本发明公开了一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法，该方法采用蛋白酶K消化动物药组分，广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取植物药组分；基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ设计水蛭特异性引物进行PCR扩增；将产物电泳检测测序，获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST进行结果判定，以相似性最高的序列物种为待测样品最接近的物种。本水蛭特异性引物可扩增140～200bp的小片段基因，能针对脑心通胶囊中水蛭粉末进行鉴定，不受水蛭的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的特点，填补了脑心通胶囊在水蛭质量控制方面的空白。

技术领域

本发明涉及一种脑心通制剂中水蛭药材的鉴别方法。

背景技术

脑心通胶囊为陕西步长制药有限公司独家单一品规的中药品种(国药准字Z20025001，规格：每粒装0.4g)，是由黄芪、丹参、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、醋乳香、醋没药、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、水蛭、全蝎等16味中药直接散粉制药而得，其功能主治益气活血，化瘀通络。用于气虚血滞、脉络痹阻所致中风，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短，脑梗塞、冠心病心绞痛的治疗。

水蛭作为脑心通胶囊的臣药之一，功能主治破血通经，逐瘀消癥。用于血瘀经闭，癥瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤。据2015年版《中国药典》(一部)记载，水蛭(Hirudo)来源为水蛭科动物蚂蝗(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman、水蛭(日本医蛭)Hirudonipponica Whitman或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭)Whitmania acranulata Whitman的干燥全体。

随着野生水蛭资源日渐萎缩，目前市场上流通的水蛭商品多以人工养殖为主，而其中宽体金线蛭和伪品菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)是主要养殖对象。因此，在现今的药材市场上，水蛭的来源相对清晰，基本上以蚂蝗(宽体金线蛭)为主，有少量的水蛭(日本医蛭)，柳叶蚂蝗(尖细金线蛭)较为罕见；伪品中则以菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis Lesson)较为常见。传统的水蛭鉴别主要以基原、性状、显微和薄层鉴别为主，专属性和特异性都不强；特别地，当药材加工切断或粉碎制成中药制剂后，性状特征消失，传统的鉴别方法难以满足实际工作需求。就脑心通胶囊而言，目前尚未有研究报道该胶囊中水蛭的有效鉴别方法，2015年版《中国药典》(一部)中也未对脑心通胶囊中水蛭的质量控制进行规定。

因此，在尚不能明确其他蛭类物种能否应用于临床的情况下，急需建立准确、方便、通用的鉴定方法来确保水蛭药材的正品基原，加强对脑心通胶囊的监管与质量控制，以保证临床用药安全。

随着分子生物学领域的迅速发展，DNA条形码分子鉴定技术应运而生，被广泛应用于市售中药材的鉴定。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，在动物类中药材中采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为主体序列，ITS2为辅助序列。近年来，国内许多研究者探讨了应用COⅠ、ITS、ITS2、12S rRNA和16S rRNA等基因序列对蛭类动物进行分类鉴别的可能性，结果表明上述基因可以在不同程度上有效鉴定蛭类动物，以判定水蛭药材的正伪。

但上述研究多以通用引物对药材DNA进行PCR，扩增的目的产物片段大小在350～700bp左右。然而，就脑心通胶囊而言，在水蛭药材的制作(晒干)、加工(粉碎)和保存过程中不免发生DNA的降解，基因裂解为小片段，不能被上述通用引物扩增出来；此外，除水蛭外，脑心通胶囊中还含有地龙和全蝎两种动物药，也可以被上述通用引物扩增出与水蛭相似大小的基因片段。因此，设计能扩增出小片段基因的水蛭特异性引物，对于脑心通胶囊中基原正品的鉴定显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对在中药制剂脑心通制剂中水蛭形态特征缺失，缺乏科学鉴定手段的现状，提供一种科学、准确、有效的分子生物学鉴定方法，该方法包括以下步骤：