[发明专利]一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达高活性冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)的基因工程菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β‑酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)同时敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本发明还提供了上述方法构建得到的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本发明的构建方法简单易操作，且得到的基因工程菌能够表达高活性的冰核蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

自然界中的水在0℃不会结冰，而是处于一种超临界状态，直至-15℃～-2℃才可结冰；纯水则需要在-40℃才可结冰。冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)是一类可以使水在较高温度下(-5℃～-2℃)形成冰晶的特殊蛋白质，对于冰核蛋白的利用，多是以冰核细菌为载体，冰核细菌主要包括草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和菠萝泛菌(Pantoea ananas)等，其在人工降雨降雪、食物冷冻保鲜及高敏检测等方面具有远大的应用前景，如：在杀虫方面，提高农业害虫的越冬死亡率是有效控制虫害的可行方法，构建促冻杀虫的基因工程菌，并使其在害虫肠道内有效定殖，可提高害虫的过冷却点，实现低温冻杀的效果，为越冬妨害提供一条途径；在食品行业，常规的低温冷冻食品，在冻结过程中因形成较大的冰晶，造成细胞损伤，解冻时细胞内容物流失，不仅破坏食品的风味，更导致营养流失，冰核蛋白能够使食物在较高的温度下快速结冰，将冰河活性细菌用于食品冷藏，不但改善了冷冻食品的品质，也节省了能源和时间；在人工降雪与降雨方面，利用冰核细菌提高液体过冷却点的特性，可以用于人工降雪和人工降雨，不但可调节天气，还可应用于体育娱乐以及北极的冰川构建等方面。

冰核蛋白的利用主要是通过调整温度、pH值等发酵条件促进冰核细菌中冰核蛋白的表达，或者通过提取纯化冰核蛋白来实现，但是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和菠萝泛菌(Pantoea ananas)等冰核细菌的遗传背景复杂，基因改造存在一定的难度，以此为工程菌对其进行改造限制了冰核活性的提高和冰核蛋白的最大性利用。纯化冰核蛋白虽然可以确保其安全性，但研究表明冰核蛋白需要和细胞膜的脂质结合才能最大程度的发挥作用，因此必须有载体菌才能实现冰核蛋白活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)同时敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述大肠杆菌为E.coliMG1655、E.coli DH5α或E.coli BW25113中的任一种。

进一步，所述大肠杆菌为E.coli MG1655。

进一步，所述β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述硫酯酶基因为拟南芥硫酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，冰核蛋白基因为来自菠萝泛菌的冰核蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。