[发明专利]一种单一转氨酶催化级联反应不对称合成L-草铵膦的方法

说明书

本发明公开了一种单一转氨酶催化级联反应不对称合成L‑草铵膦的方法，该方法包括：以4‑(甲基羟基磷酰基)‑2‑羰基‑丁酸或其盐为底物，在氨基供体存在的反应体系中，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物，发生转氨反应，得到L‑草铵膦；所述氨基供体为L‑谷氨酸和L‑天冬氨酸；反应体系中仅添加一种转氨酶，且该转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明方法采用的转氨酶ATA117‑rd11催化级联反应生产L‑草铵膦工艺既解决了现在使用单一转氨酶工艺中氨基供体用量过高的问题，又解决了现有两种转氨酶工艺中生物催化剂成本偏高、发酵工序繁琐以及反应时间偏长的技术难题。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种单一转氨酶催化级联反应不对称合成L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为Phsophinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，是一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂，是目前转基因抗性作物理想的除草剂，应用前景非常广阔。草铵膦具有两种对映异构体，但只有L-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

生成L-草铵膦的方法有化学合成法、发酵法、生物合成法。其中，生物合成法中涉及到的酶类主要有：蛋白酶、脱乙酰基酶、转氨酶、酰胺酶、酯水解酶和腈水合酶。在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。

转氨酶(Amine Transaminase,ATA,EC2.6.1.X)属于转移酶类，是催化1个氨基供体(氨基酸或简单的胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸的一类酶，反应过程需要磷酸吡哆醛(Pyrid oxal phosphate,PLP)的参与，其催化的反应是可逆的。根据氨基被转移到不同位置的氨基受体上，转氨酶又可以被分为α-转氨酶和ω-转氨酶(EC 2.6.1.1)ω-转氨酶反应过程可分为两步，第一步反应是在ω-转氨酶的作用下将氨基供体上的氨基转移到PLP的羰基上，从而形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和与氨基供体对应的酮；第二步反应同样在ω-转氨酶的作用下将PMP上的氨基转移到氨基受体上，PMP又转变为PLP实现循环。

Schulz A等利用从E.coli K-12中分离到的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰胺)丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，利用转氨作用生产L-草铵膦(Stereospecificproduction of the herbicide phosphinothricin(gluf osinate)by transamination:isolation and characterization of a phosphinot hricin-specific transaminasefrom Escherichia coli[J].Applied and Envir onmental Microbiology,1990,56(1):1-6)，产物最高浓度可达76.1g/L。转氨酶经固定化后安装至生物反应器，反应器的最高产物生成速率为50g/(L.h)，草铵膦e.e.值超过99.9％。但这个工艺有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给分离带来了很大的麻烦，问题的关键在于以L-谷氨酸作为氨基供体时酶促转氨反应是一个可逆反应。