[发明专利]一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采用以下方法制备：

取新生儿脐带，用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于0.2％Ⅱ型胶原酶溶液中消化；消化离心弃上清两次后，加DMEM/F12培养基和胎牛血清培养；细胞于贴壁生长后，用DMEM/F12完全培养基进行换液，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。

2.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，其使用的新生儿脐带，是足月产新生儿，且产妇的乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体免疫4项均为阴性的健康产妇。

3.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将脐带在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4cm大小节段，进入下一工序。

4.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，取每一节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃恒温消化18小时，进入下一工序。

5.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，0.2％胶原酶溶液的制备方法是：100mgⅡ型胶原酶加入50ml DMEM/F12培养基，完全溶解后，0.22μm过滤除菌。

6.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，消化后至无组织块时，采用2500rpm离心，共10min，后弃上清并进入下一工序。

7.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃，5％CO2条件培养进入下一工序。

8.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，DMEM/F12完全培养基的制备方法：450ml DMEM/F12培养基内加入50ml特级胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培养基，加入青霉素及链霉素，使浓度为100u/mL青霉素、100μg/m L链霉素。

9.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，进行传代培养的方法是：待细胞融合达到80-90％时，弃上清，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心，弃上清后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。