[发明专利]一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种人脐带华通胶间充质干细胞(Wharton’s jelly‑derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)的制备方法。本发明所述WJMSCs来自于足月产健康新生儿脐带。本发明所述脐带华通胶间充质干细胞，增殖分化能力强，生物性能稳定，其不表达MHC‑II，MHC‑I的表达远低于骨髓间充质干细胞，且来源广泛，取材方便，供者无痛苦，易于收集、提取和保存，且相对纯净，污染少，具有广阔的临床应用前景。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞是来源于中胚层的干细胞，是一种非造血来源的多向分化潜能的干细胞。由于其免疫源性弱，并能向多种组织增殖分化，因此，已经成为组织工程技术领域及细胞移植治疗中理想的种子细胞来源。最早，在人骨髓中发现间充质干细胞，然而，骨髓中还存在大量其他细胞，如造血细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等，间充质干细胞含量相对较少，分离纯化相对困难，同时发现，随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞的数量和增殖分化能力均显著下降。同时，获取骨髓组织对供者带来较大困苦和创伤，难以广泛应用于临床。

相比于骨髓间充质干细胞，华通胶间充质干细胞，来源于新生儿脐带，属于医疗废弃组织，对供者不产生困苦和损伤，且来源广泛，因此更容易得到推广应用于临床。华通胶组织是脐带动静脉之间的胶冻样间质，含有较多胶原纤维，胶原酶能够水解华通胶组织的胶原纤维结构，但不会对WJMSCs造成损伤。

发明内容

为了较少对供者的创伤，获取生物纯度及活性更高的间充质干细胞，本发明提供一种WJMSCs的制备方法。其技术方案如下：

本发明任一项所述WJMSCs的制备方法，包括以下步骤：

1、试剂配制

(1)0.2％II型胶原酶100mg II型胶原酶加入50mlDMEM/F12培养基，完全溶解后，0.22μm过滤除菌。

(2)DMED/F12完全培养基

450ml DMEM/F12培养基内加入50ml特级胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培养基，加入青霉素及链霉素，使浓度为100u/mL青霉素、100μ g/mL链霉素。

2、WJMSCs分离培养步骤

(1)取足月产健康新生儿脐带约30cm，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存；

(2)在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4 cm大小节段，取每一节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置 37℃恒温消化18小时；

(3)观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10min，弃掉上层上清，剩余粘稠状液体再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟；

(4)消化后2500rpm离心10min，弃上清，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃，5％CO2条件培养；

(5)细胞于第2天开始贴壁生长，第4天用含20％胎牛血清的DMEM/F12 完全培养基进行换液；

(6)以后每2到3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养；

(7)弃上清，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心，进行细胞传代；

(8)传代后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。