[发明专利]检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用

说明书

本发明公开检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用。本发明提供的分子标记能对油菜BnALS1R基因SNP突变位点的A或G碱基进行特异的区分和检测。发明提供的SNP分子标记的应用方法准确可靠，操作简便，适用于油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R基因型的鉴定及辅助选择育种。本发明提供的分子标记只需PCR和荧光检测两个步骤，成本低、通量高、加上特异性高，特别适用于育种群体中不同抗性基因型的分类筛选与鉴定。

技术领域

本发明涉及作物分子遗传育种技术领域，具体涉及检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用。

背景技术

油菜(Brassica napus L.)是世界范围内广泛种植的重要油料作物，也是我国第一大油料作物。菜籽油不仅可以作为食用油，也是润滑油及生物柴油等工业原材料。我国国产菜籽油占国产油料作物产油量的55％以上，发展油菜生产对维护国家食用油供给安全具有重要的战略意义(王汉中，中国油料作物学报，2018，40(5)：613-617)。然而，随着我国油菜种植方式由传统的劳动密集型向规模化、机械化生产发展，杂草危害已成为制约油菜全程机械化生产、轻简化栽培的重要环节之一。我国油菜田杂草种类多、数量大、危害重，长江流域冬油菜区杂草危害面积达46.9％，北方春油菜区草害面积高达90％以上，且以双子叶杂草为主。占全国油菜面积90％的冬油菜区，田间草相可分为两大类，稻茬油菜田为禾本科杂草和阔叶杂草混生型，旱茬油菜田以阔叶杂草为主(王汉中.中国油菜生产抗灾减灾技术手册.北京：中国农业科学技术出版社，2009：91-95)。生产上使用稳杀得、盖草能、禾草克等除草剂能有效防除油菜田单子叶杂草，对减轻杂草危害、降低人工除草劳动强度和提高油菜产量起到一定的作用。但对绝大多数阔叶杂草，目前生产上尚未开发出安全高效的除草剂。

咪唑啉酮类除草剂是目前应用较广泛的一类除草剂，具有选择性强、广谱、高活性，可进行播前混土、苗前土表处理及茎叶喷雾，经植物根与叶吸收，既能防除一年生禾本科与阔叶杂草，也能防除多年生杂草。但该类除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也会产生药害，极大限制了其使用时间和空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽咪唑啉酮类除草剂的使用范围。研究表明，乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)是咪唑啉酮类除草剂的靶酶，当ALS基因核酸序列变异造成编码蛋白氨基酸残基位点改变时，可以引起除草剂与ALS结合方式的变化产生抗性。

2004初夏，江苏省农业科学院经济作物研究所浦惠明研究员在喷施咪唑啉酮类除草剂“豆施乐”的油菜和大豆轮作育种田中发现1株未被除草剂杀死的油菜植株，将其移入人工生长箱春化，并直至油菜开花结荚成熟。随后，通过连续多年自交及小孢子培养得到了抗性株系M9。多次抗性效应鉴定发现，M9抗除草剂的浓度是除草剂有效杀草浓度的2～3倍，抗性稳定、具有利用价值。笔者从M9中克隆到抗性基因BnALS1R发现，抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP，导致ASL1的第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。抗性基因BnALS1R的发现为我国提供了具有自主知识产权的抗除草剂基因，若能进一步找到与抗性基因紧密连锁的分子标记，则能进行标记辅助选择，指导田间育种，提高育种选择效率。

专利CN102766697B中公开了一种三引物分子标记检测抗性基因BnALS1R基因型的方法。该方法引物设计较为复杂、操作繁琐，需要做2次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳检测，难以满足油菜田间育种选择的高通量需求。并且PCR产物检测过程中使用的EB易对环境造成污染、对人体产生危害。

开发准确、灵活、操作简便检测抗性基因BnALS1R基因型的分子标记及建立高效、环境友好高通量的相关检测体系，则对促进BnALS1R基因在商业化育种中的应用具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了BnALS1R基因的SNP标记引物。