[发明专利]一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和材料

说明书

本发明公开了一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI突变体，命名为e‑BTI，其特征在于，根据BTI的基因序列，设计突变引物，对BTI的S41T以及P44T位点进行突变得到。本发明制得的e‑BTI热稳定性明显高于BTI，而且显示出优异的和胰蛋白酶的特异亲和性。可以采用所述e‑BTI制备胰蛋白酶亲和材料用于分离、提纯和鉴定胰蛋白酶。本发明采用简单的方法制得重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e‑BTI，并且采用其突变体得到的胰蛋白酶亲和材料对胰蛋白酶的选择性吸附高、非选择性吸附低，利用不同洗脱液对胰蛋白酶吸附和分离，经过一步纯化便可得到高纯度的目的胰蛋白酶，最终纯化得到的胰蛋白酶具有高的催化活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和材料。

背景技术

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca²⁺的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶作为蛋白酶的一种，不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在测定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。此外胰蛋白酶还有抗炎症作用，临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。还可用于治疗毒蛇咬伤，也常用于动物细胞培养前对组织的处理。

在动物胰脏中含有大量的胰蛋白酶，大多数以酶原非活性的形式存在，经胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，此外在动物胰脏中大部分的酶为丝氨酸蛋白酶家族，特别是糜蛋白酶原与胰蛋白酶原的理化性质相近，难以将二者分离。目前国际上通用的动物组织提取药用蛋白工艺是基于传统的盐析、沉淀等方式，这种工艺提取特异性差，操作过程目标产品损失大，产品活性低。目前市场上的通用纯化介质和纯化技术，如超滤、分子筛凝胶层析、离子交换凝胶层析、疏水凝胶层析等技术，由于这些纯化介质和方法的纯化效率低、往往需要多介质与多个步骤组合才能达到产品质量要求，难以形成产业化。目前虽然有牛和猪来源的胰蛋白酶已经商业化，然而，胰蛋白酶在自然界很多物种中普遍存在，其性质不尽相同，可用于不同领域。如哺乳动物来源的胰蛋白酶最适作用温度多为50℃左右，在低温(如低于20℃)时活性较低，而某些深海生物来源的胰酶最适作用温度为20℃左右。在某些技术领域，如食品或药品加工制造领域，需要低温催化，可减少热能消耗、更多地保留热敏营养成分或减少副产物的生成等。因此若能制备胰蛋白酶亲和材料，可有效分离得到许多未知酶类，开拓新型酶的研究与应用，具有巨大的科研意义和市场前景。

亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术，如酶和酶抑制剂之间有一种特殊的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体上，则可从溶液中专一地分离和提纯另一方。与其他纯化方法相比，亲和层析能产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速，有时仅一步即可达到纯化的目的。将酶抑制剂固定做成亲和层析材料特异吸附纯化对应的酶是一种有效可行的方法。然而，亲和层析支持物需满足非特异性吸附低，纯度高，亲和作用力强，稳定性好等特点，寻找合适的抑制剂是制备酶亲和材料首要关键问题。

专利文献CN201810669013.6公开了一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法，其是以太子参为原料，经过粗提、分级沉淀和柱层析制备得到。但一方面太子参作为原料价格昂贵，不适于工业化的生产，而且温度对其蛋白抑制活性影响较大，80℃以上时，残留抑制率就有较大程度的下降。专利201410440706.X公开了一种应用毕赤酵母分泌表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，省去变性和复性过程，可直接从培养基中获得酶原，通过肠激酶酶切，再经纯化等步骤得到了高活力的牛胰蛋白酶，但由于牛胰蛋白酶原分子量较大，分泌量有限，故最终获得酶含量较低。专利文献CN 201610973326.1公开了一种重组牛胰蛋白酶抑制剂突变体及其制备方法，但是其制备方法繁复，而且重复性不好，其作为胰蛋白亲和材料的前景不被看好。