[发明专利]同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒。上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌和赭曲霉毒素产生菌。基于多重PCR检测方法，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对。本发明建立了一种不经过分离纯化，直接检测中药材污染产毒真菌的多重PCR体系，各引物特异性强，方法的检出限为10²～10³CFU/g，检测灵敏度高。

技术领域

本发明涉及同时检测4类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒，属于生物技术检测领域，特别涉及同时检测中药材污染4类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒。

背景技术

中药材受自身性质(含有大量淀粉、多糖等)的影响，在生产、加工、运输、贮存过程中，很容易污染各种真菌而发生霉变，不但药效价值降低，人误服后会引起中毒。针对上述中药材受真菌污染问题，我国已经制定了若干管理规范，但污染检测方面仍然存在许多空白。

例如《中国药典》仅对强致癌物黄曲霉毒素规定了检测方法和限量标准，《中国药典》2015年版一部收录了桃仁等十九味中药中黄曲霉毒素的检测方法，而对赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素等其他多种真菌毒素没有相应的限量要求，也缺乏相应的数据支持。虽然目前已经对真菌毒素出台了相关限量标准。然而，真菌毒素的检测方法只能在真菌产生真菌毒素的情况下才能发挥作用，无法在产毒真菌尚未产生真菌毒素时，主动采取相关防范措施。一旦所检中药材的真菌毒素含量超标，只能采取抛弃等被动处理方法，很容易造成资源浪费。因此，建立一种针对中药材污染真菌的预警方法是非常必要的。

目前，在产毒真菌的种类检测和鉴定方面已有深入的研究和广泛的应用。比较成熟的方法是多聚酶链式反应(PCR)技术、分子标记技术等。其中，PCR技术是建立中药材污染真菌的检测方法的有效手段。多重PCR检测技术，是指在一个PCR反应体系中加入两对或者两对以上引物，能够同时扩增出多个DNA片段，具有高效、快速、经济等优点。国内外均有不少研究报道。实现多重PCR检测，引物的设计极为关键，直接影响着方法的特异性。例如：在赭曲霉毒素生物合成途径基因PKS设计引物AoLC35 12L/AoLC35 12R和AoOTAL/AoOTAR，其中AoLC35-12L/AoLC35-12R引物仅仅对产赭曲霉毒素产生菌特异性，该二重PCR检测方法成功鉴别赭曲霉毒素产生菌与不产毒菌株。Rodríguez等根据fluG该基因设计了特异性引物F-FluGc/R-FluGc，建立的多重实时荧光定量PCR，成功鉴别产杂色曲霉毒素菌株与不产毒菌株。

秦文彦等根据黄曲霉毒素生物合成途径中aflR、ver-1、omtA-1等基因上设计引物，成功建立了多重PCR检测方法，并应用于食品及饲料表面中污染的黄曲霉菌和寄生曲霉菌的检测。结果显示，aflR、ver-1和omt-1基因上设计的引物能够扩增出相应大小、清晰明亮的电泳条带。而其余如青霉、烟曲霉、杂色曲霉和黑曲霉菌株的样品只检测出真菌保守区域共有的ITS片段。上述文献报道均仅仅针对一类产毒真菌，例如黄曲霉毒素产生菌、赭曲霉毒素产生菌或者杂色曲霉毒素产生菌，而对于该四类产毒真菌之间的组合的检测方法的相关报道甚少。目前，针对产毒真菌分子鉴定方法很多，但仅仅针对一类产毒真菌或者两类产毒真菌，检测范围小，没有系统性对中药材受产毒真菌污染的情况进行详细的分析。

传统的中药材污染产毒真菌分子鉴定方法需在菌株分离、纯化的基础上进行种属的鉴定以及产毒性能的分析，操作步骤多、周期长，无法做出及时的判断，更无法对中药材在加工、生产过程中真菌的污染水平进行监控。目前尚未见不经过分离纯化，直接对中药材污染产毒真菌进行多重PCR检测分析。目前产毒真菌DNA的提取方法主要有NaOH裂解法、Chelex-100裂解法、CTAB法等，不仅经济实惠，而且提取效率高。

综上所述，在食品及农产品中污染的产毒真菌的分子鉴定方法(单重PCR和多重PCR)，已经是非常成熟。但是，对于中药材感染产毒真菌的多重PCR方法研究相对较少，尚未成熟，原因之一是中药材基质比较复杂。