[发明专利]多种改进型橙/红色荧光蛋白

说明书

本发明涉及多种改进型橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed氨基酸序列的改造，获得的新型荧光蛋白与野生型具有不同的特点。本发明获得了一种与mOrange2类似但更亮的单体结构橙色荧光蛋白，其荧光亮度比mOrange2高2.0倍。本发明还获得了一种新型的紫红色荧光蛋白，该荧光蛋白具有特异性的最大激发波长和最大发射波长。本发明还涉及将改进型的荧光蛋白用于多领域的研究，采用将荧光蛋白融合在靶标蛋白N端或C端，在细胞系或活体动物中表达该融合蛋白，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等多种进行分析。

本申请是申请号为201510003374.3、申请日为2015年01月06日、发明名称为“多种改进型橙/红色荧光蛋白”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一些改进型的橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed序列的改造，所得新型荧光蛋白与野生型具有明显不同的颜色(激发光谱和发射光谱)、荧光强度等特点。本发明还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及其可与蛋白在N端或在C端融合，在细胞系或活体动物中表达，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等进行多种分析。

背景技术

荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应用。尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用。荧光标签众多，如何选择荧光蛋白更好的显示靶标蛋白的示踪和功能，主要考虑以下几个方面：1)荧光蛋白表达亮度高，无毒性；2)荧光蛋白具有很好的光稳定性；3)不能选择多聚体的荧光蛋白；4)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；5)要有多通道，不相互干扰的荧光蛋白。

红色荧光蛋白drFP583(DsRed)是从Discosoma sp.分离得到的(Matz et al.,Nature Biotech.17:969-973(1999),Gross et al.,Proc.Nat'LAcad.Sci.USA97:11990-11995(2000))，其优点显而易见：可与GFP系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，能够与现有的共聚焦和宽视场显微镜滤光片等具有很好的包容性，红光的穿透性尤其适用于对活体动物组织的成像，因而红色荧光蛋白显得尤为重要。在哺乳动物细胞中，无论是自发荧光还是对红光区的光吸收都大为减少，因此红色荧光探针的发展对于检测厚标本和活体动物成像都是非常重要的。在后续的荧光使用中，逐渐在荧光蛋白的单体化，适应多细胞区域表达，荧光稳定性等多方面对红色荧光蛋白有了更多的需求，而DsRed为4聚体蛋白，高度聚集的形式不利于与蛋白融合表达来观察蛋白的表达定位，功能等的能力，因此开展了更大规模的红色荧光蛋白突变体筛选工作。但将DsRed突变为单体后，其光稳定性大大缩短，无法满足共聚焦的成像要求，并且由于改变了发光体的结构，容易形成更多不同颜色差异的红色荧光蛋白。因此，目前红色荧光蛋白进化的焦点集中在两个目标上，第一完善当前己有的单体红色荧光蛋白，使得它们的荧光特性或稳定性等特征进一步优化；第二是开发能发红光的荧光蛋白，甚至是发射波段处于远红外区的荧光蛋白。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。