[发明专利]一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法

权利要求书

1.一种烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 依据GenBank收录的NtNHX2基因序列LOC107808863，用DNAMAN 软件设计出基因克隆引物：正向引物：NtNHX2-F：ATGGCGTCTGAGCTGGC；反向引物NtNHX2-R：TCATGGTTCCTGTTCCGTTG；

b. 利用Trizol试剂提取烟草幼苗总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物NtNHX2-F/NtNHX2-R进行PCR扩增；

c. 使用DNA凝胶纯化回收试剂盒将目的片段纯化，将其与pMD19-T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后将感受态细胞加入到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上涂板，37℃过夜倒置培养;

d. 用牙签挑取少量菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行测序。

2.根据权利要求1所述烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于：对阳性克隆测序结果显示目的片段大小为1605bp。

3.根据权利要求1所述烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于：步骤b中所述的扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸8min。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于：步骤b中所述的烟草幼苗由烤烟K326种子培育而得。

5.一种如权利要求1所述烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

①对烟草幼苗进行高盐、低钾处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行高盐、低钾处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；

②对烟草幼苗进行干旱、4℃、ABA处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行干旱、4℃、ABA处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；

③不同非生物逆境胁迫下对烟草NtNHX2基因的表达分析：根据NtNHX2基因序列LOC107808863，采用DNAMAN设计qRT-PCR引物：

正向引物：NtNHX2-qF：CACCGCAGAGGCAGTTAA；

反向引物：NtNHX2-qR：GTTGGCGCAGAAAGTAGC，分别采用经步骤①、步骤②处理所得烟草幼苗的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达量用2^-ΔΔCt方法进行计算；3次重复，试验结果以测定的基因相对表达水平平均值表示。