[发明专利]一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法

说明书

本发明提供一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法，以烟草幼苗总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500‑2000bp的位置上有一条清晰的条带，条带单一，无弥散现象，长度大小与预期目标相符,对该条带进行回收、纯化测序，测序结果显示目的片段大小为1605bp；然后根据该NtNHX2基因序列，采用DNAMAN设计qRT‑PCR引物NtNHX2‑qF、NtNHX2‑qR，以烟草的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达水平用2^‑ΔΔCt方法进行计算；3次重复，运用qRT‑PCR分析NtNHX2在不同组织中的特异性表达及其在高盐、低钾、干旱、4℃、ABA胁迫下的基因表达水平，为NtNHX2的功能研究、探讨其耐盐机制及基因利用提供理论依据。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法。

背景技术

烟草是我国重要的经济植物，提高烟草的品质与产量对我国的经济收入及烟区农业经济发展有着重要作用。如今土壤盐碱化、干旱、低温等胁迫严重影响烟草的产量与品质，因此如何提高其抗逆性已然成为了目前烟草研究的一个重要课题。

烟草为响应外界逆境胁迫及自身生长发育的信号，必须通过保持细胞内离子平衡来维持自身正常的生理代谢，而含有Na+/H+ 交换结构域（Pfam：PF00999）的一类离子转运蛋白NHX(Na+/H+反向转运载体)，则在离子转运及平衡过程中起了重要作用，其中NHX1属于NHX Ⅰ类，为Na+/H+逆向转运蛋白，有利于植物提高耐盐性。

因此，研究烟草NtNHX2基因不仅可明确NtNHX2在烟草中的功能，而且有助于理解烟草对非生物逆境胁迫的应答机制。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种烟草NtNHX2基因的克隆以及烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法。本发明科学合理，为NtNHX2的后续功能研究、探讨其响应非生物逆境胁迫机制奠定基础。具体技术方案如下：

一种烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 依据GenBank收录的NtNHX2基因序列LOC107808863，用DNAMAN 软件设计出基因克隆引物：正向引物：NtNHX2-F：ATGGCGTCTGAGCTGGC；反向引物NtNHX2-R：TCATGGTTCCTGTTCCGTTG；

b. 利用Trizol试剂提取烟草幼苗总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物NtNHX2-F/NtNHX2-R进行PCR扩增；

c. 使用DNA凝胶纯化回收试剂盒将目的片段纯化，将其与pMD19-T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后将感受态细胞加入到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上涂板，37℃过夜倒置培养;

d. 用牙签挑取少量菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行测序。

进一步地，对阳性克隆测序结果显示目的片段大小为1605bp。

进一步地，步骤b中所述的扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸8min。

进一步地，步骤b中所述的烟草幼苗由烤烟K326种子培育而得。

一种烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法，包括以下步骤：

①对烟草幼苗进行高盐、低钾处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行高盐、低钾处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；