[发明专利]一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法

权利要求书

1.一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法，其特征在于具体包括如下步骤

(1)花蕾的选取：选取花瓣与花药长度比为1:1的花蕾；

(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾消毒清洗后用1/2NLN-13培养基润洗；将润洗后的花蕾充分研磨，过滤，离心，黄绿色沉淀用添加1号培养基稀释，分装到培养皿中热激处理，24-26℃暗培养14-16天，形成胚状体；所述的1号培养基为添加0.04～0.08mg/L6-BA、10～20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN-13培养基；

(3)成熟胚萌发成植株：将胚状体至于1号培养基中进行振荡培养，将其中转绿的成熟胚转移到固体2号培养基中培育38-50d，直接进行炼苗移栽；所述的固体2号培养基为添加0.02mg/L NAA、2mg/L 6-BA、3％蔗糖和1.2％琼脂的1/2MS培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中1号培养基为添加0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN-13培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中选用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液对花蕾进行消毒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)过滤选用细胞过滤器；所述细胞过滤器的直径优选为直径24mm，孔径为40μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中黄绿色沉淀用1号培养基稀释至细胞数为10⁵个每毫升。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中每个培养皿分装2ml，热激处理条件为32-34℃热激处理1-2天。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中热激处理和暗培养所用的培养基为含有0.08mg/L6-BA、20mg/L抗坏血酸和1mg/mL的活性炭的NLN-13培养基。

8.一种不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，其特征在于包括：

(1)取样提取及染色：取其鲜嫩叶片，加入提取液，高通量组织磨样器研磨，过滤，离心，弃上清液染色，静置15min；所述的提取液配方为：10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/L KCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)Triton X-100和1％的PVP，调其pH至8.0，4℃保存；所述的染色液配方为：10mmol/L MgSO4·7H₂O、50mmol/L KCl、5mmol/L HEPES、0.25％(v/v)TritonX-100、0.4mg/ml碘化丙啶(PI)和0.04mg/ml RNase，现配现用；

(2)流式细胞仪倍性分析：采用美国Beckman Coulter公司生产的CytoFLEX型号的流式细胞仪；以普通白菜2n＝20为对照，二倍体2C峰在150附近，4C峰在300附近，待测植株2C峰在150附近，4C峰在300附近视为二倍体，2C峰在75附近，4C峰在150附近视为单倍体，2C峰在300附近，4C峰在600附近视为四倍体。

9.根据权利要求8所述的不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，其特征在于步骤(1)中鲜嫩叶片为50-200mg，洁净无病虫害；每个样品中加入1-1.5ml提取液。

10.根据权利要求8所述的不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法，其特征在于磨样选用高通量组织磨样器SCIENTZ-48，60Hz，3min；过滤选用细胞过滤器，所述细胞过滤器的直径优选为直径24mm，孔径为40μm；离心选用离心机，转速及时间为5000r/min、5min。