[发明专利]一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法

说明书

本发明公开了一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法。一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法，包括：(1)采集花蕾；(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾消毒清洗、润洗；将润洗后的花蕾研磨，过滤，离心，黄绿色沉淀用添加1号培养基稀释，进行热激处理，24‑26℃暗培养14‑16天，形成胚状体；1号培养基为添加0.04～0.08mg/L6‑BA、10～20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN‑13培养基；(3)成熟胚萌发成植株。本发明所述方法在能够保证出胚率的情况下，简化操作步骤，大大减少了操作时间，提高了植株生产效率。

技术领域

本发明属于组培领域，涉及一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法。

背景技术

小白菜主要是异花授粉植物，在传统育种工作中，需要得到纯化亲本只能通过常规自交，由于自交衰退，纯合亲本的选育就是一个非常困难的问题，并且用时长，耗费人力以及财力，育种效率很低。小孢子培养技术是利用细胞全能性，将单个细胞培养成纯合植株的过程，能够有效的缩短育种年限，很短的时间内就可获得大量的纯合植株，大大的提高了育种效率。lichter1982年首次在甘蓝型油菜上发现，利用小孢子培养技术可以获得胚状体，从此芸薹属蔬菜小孢子培养方面不断取得新的进展，目前在芸薹属青花菜、大白菜、甘蓝、不结球白菜等品种上都取得了成功。在我国，这项技术相对起步比较迟，主要是在借鉴国外的知识上，迅猛发展起来的，1993年曹鸣庆首次成功利用游离小孢子培养技术培育出了胚状体，后来这项技术在我国快速发展，在芸薹属的许多品种中都取得了突破性的进展，并且在芸薹属的青花菜、芥蓝、花椰菜中获得了小孢子再生植株。但目前该技术出胚率低，且污染问题较为严重。

不结球白菜难以鉴定其倍性，因为其从苗期到花期没有明显的形态学特征，尽管在花期单倍体会产生发育不良的花或者败育的花粉，部分四倍体株型较大或有较大的花，但是二倍体和四倍体依然难以区分。因此,长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性,主要方法有花粉粒大小判别法、根尖染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等。这些方法费时费力且不准确。

流式细胞术(flow cytomertry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一项技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,可以定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某种特异蛋白的含量,以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量。流式细胞术不受植物取材部位和细胞所处时期的限制,制样简单,灵敏度、分辨率及准确性较高,数据的可重复性好,测试速度快,适合于样品较多的倍性检测分析。目前流式细胞术已经普遍应用于植物基因组大小或者植物倍性研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法。

本发明的另一目的是提供一种不结球白菜小孢子植株倍性鉴定方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明采取的技术方案：

一种提高不结球白菜小孢子胚胎诱导率的方法，具体包括如下步骤

(1)花蕾的选取：选取花瓣与花药长度比为1:1的花蕾；

(2)培育小孢子胚胎：将步骤(1)采集的花蕾消毒清洗后用1/2NLN-13培养基润洗；将润洗后的花蕾充分研磨，过滤，离心，黄绿色沉淀用添加1号培养基稀释，分装到培养皿中热激处理，24-26℃暗培养14-16天，形成胚状体；所述的1号培养基为添加0.04～0.08mg/L6-BA、10～20mg/L抗坏血酸和1mg/mL活性炭的NLN-13培养基；

(3)成熟胚萌发成植株：将胚状体至于1号培养基中进行振荡培养，将其中转绿的成熟胚转移到固体2号培养基中培育38-50d，直接进行炼苗移栽；所述的固体2号培养基为添加0.02mg/L NAA、2mg/L 6-BA、3％蔗糖和1.2％琼脂的1/2MS培养基。