[发明专利]一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法

权利要求书

1.一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)在血浆中加入PEG-6000，采用PEG沉淀法除去血浆中的球蛋白，保留含有血浆白蛋白的上清液待用；定性分析进入步骤(2)，定量分析进入步骤(3)；

(2)采用亲和色谱分离糖基化HSA；

(3)HSA还原烷基化；

(4)将胰蛋白酶加入还原烷基化后的蛋白质溶液中，胰蛋白酶与蛋白质溶液的质量比为1:25，在37℃下孵育过夜；定性分析进入步骤(8)，定量分析进入步骤(5)；

(5)标记用于定量实验的酶解HSA；

(6)采用亲和色谱柱分离标记后的糖基化HSA肽段；

(7)C18 Ziptip脱盐；定量分析进入步骤(9)；

(8)纳升液相色谱-多级质谱定性分析：

将步骤(4)中经过胰蛋白酶酶解的糖基化HSA溶于去离子水，配制成浓度为1μg/uL的溶液；

流动相A：含0.1％甲酸的2％乙腈溶液；

流动相B：含0.1％甲酸的98％乙腈溶液；

用ReproSil-Pur C18-AQ Trap色谱柱和ReproSil-Pur C18-AQ色谱柱分离，流速为300nL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，0％流动相B；5～20min，0％～10％流动相B；20～65min，10％～32％流动相B；65～85min，32％～50％流动相B；85～90min，50％～100％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～102min，100％～0％流动相B；102～120min，0％流动相B；定性分析进入步骤(10)；

(9)纳升液相色谱-多级质谱-iTRAQ标记定量分析：

将步骤(7)中经过胰蛋白酶酶解的iTRAQ标记的糖基化HSA溶于去离子水，配制成浓度为1μg/uL的溶液；

流动相A：含0.1％甲酸的2％乙腈溶液；

流动相B：含0.1％甲酸的98％乙腈溶液；

用ReproSil-Pur C18-AQ Trap色谱柱和ReproSil-Pur C18-AQ色谱柱分离，流速为300nL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，0％流动相B；5～20min，0％～10％流动相B；20～65min，10％～32％流动相B；65～85min，32％～50％流动相B；85～90min，50％～100％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～102min，100％～0％流动相B；102～120min，0％流动相B；定量分析进入步骤(11)；

(10)在正离子模式下用高分辨质谱仪进行定性分析，得到高分辨质谱图；定性分析进入步骤(12)；

(11)在正离子模式下用高分辨质谱仪进行定量分析，得到高分辨质谱图；定量分析进入步骤(13)；

(12)根据步骤(10)中获得的高分辨质谱图，使用Proteome Discoverer软件实现对HSA糖基化位点的定性分析；

(13)根据步骤(11)中获得的高分辨质谱图，使用Proteome Discoverer软件实现对HSA糖基化位点的定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PEG沉淀法去除血浆中的球蛋白，包括步骤如下：在新鲜血浆中加入适量的PEG-6000，其中血浆与PEG-6000的体积质量比为1μL:100μg，振荡混匀后，4℃离心，取含有HSA的上清液待用。