[发明专利]一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，将血浆白蛋白还原烷基化和胰蛋白酶酶解后，通过“纳升液相色谱‑多级质谱(nL‑MSn)结合“同位素标记的相对定量和绝对定量技术(iTRAQ)”定性定量分析血浆白蛋白非酶糖基化。通过还原烷基化及胰蛋白酶酶解将血浆白蛋白降解成肽段，通过纳升液相分离后再通过高分辨率质谱获取氨基酸序列、糖基化位点信息，并通过iTRAQ报告离子实现糖基化位点的准确定量。本发明实现了对血浆白蛋白糖基化位点全面的定性和定量分析，可用于监测血糖浓度和早期糖尿病的检测。

技术领域

本发明涉及一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，具体涉及一种将血浆白蛋白还原烷基化和胰蛋白酶酶解后，通过“纳升液相色谱-多级质谱(nL-MSn)结合同位素标记的相对定量和绝对定量技术(iTRAQ)”定性定量分析血浆白蛋白非酶糖基化的方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

糖尿病是一种常见的慢性疾病，患者长期高血糖导致各种病理变化，包括过度产生晚期糖基化终末产物(AGEs)。AGEs是蛋白质、脂类和核酸的总称，它们在没有糖基转移酶参与的情况下通过还原糖或糖衍生物经历不可逆的共价修饰，这一过程称为非酶糖基化。血浆白蛋白(HSA)是最常见的非酶糖基化蛋白。糖尿病患者的HSA糖基化水平显著高于健康个体。糖基化HSA因其较长的半衰期和较高的血浆浓度，已被用于糖尿病的早期检测。

中国专利文献CN208568803U公开了一种糖化血清白蛋白检测试剂盒，结合干式免疫荧光法检测人糖化血清白蛋白占血清白蛋白的比值。通过针对糖化血清白蛋白以及非糖化血清白蛋白的特异性单抗实现了检测准确性和特异性，同时利用免疫法并借助纳米荧光微球检测糖化白蛋白，具有便捷，灵敏度高的特点。然而，由于HSA上存在大量的潜在糖基化位点且糖基化状态复杂，糖尿病患者的糖基化位点与正常人糖基化位点并不完全一致且同一位点糖基化程度也有很大不同，因此HSA总糖基化水平并不能提供用于评估糖尿病患者病症的充分信息。

文献Andrej Frolov,et al.Anal Bioanal Chem,2014,406(13):5755-5763.报道了一种从二型糖尿病患者血浆中定性及相对定量分析蛋白糖基化位点的方法，该方法简单灵敏，但无法提供糖基化位点绝对含量的信息，普通的同位素标记法实现绝对定量，又无法满足实际应用中高通量短时间的要求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种高通量、高准确度的“纳升液相色谱-多级质谱(nL-MSⁿ)结合同位素标记的相对定量和绝对定量技术(iTRAQ)”方法，定性定量分析糖基化的血浆白蛋白(HSA)，可用于监测血糖浓度和早期糖尿病的诊断。

术语说明：

Sorbitol：山梨糖醇。

HAS：血浆白蛋白。

EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二钠。

DTT：二硫苏糖醇。

IA：碘代乙酰胺。

Tris-HCl：三(羟甲基)氨基甲烷。

Guanadine-HCl：盐酸胍。

EDTA：乙二胺四乙酸。

TEAB：三乙胺硼烷。

ACN：乙腈。

TFA：三氟乙酸。

发明详述

一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，包括步骤如下：

(1)在血浆中加入PEG-6000，采用PEG沉淀法除去血浆中的球蛋白，保留含有血浆白蛋白的上清液待用；定性分析进入步骤(2)，定量分析进入步骤(3)；